人巨细胞病毒PP65基因的原核表达及初步应用

发布时间：2017-05-31 14:16

  本文关键词：人巨细胞病毒PP65基因的原核表达及初步应用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)是疱疹病毒科中最大的一种病毒。HCMV在人群中感染广泛,在正常人群中通常造成无症状感染或持续感染,但在免疫缺陷患者中可引起严重后果。孕妇感染HCMV后,容易经母婴途径传播给胎儿,造成胎儿畸形、智力低下、神经系统异常。因此孕妇的产前检测意义重大。酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种最常用的检测HCMV抗体的方法。然而,大多ELISA商品试剂盒所用的是单表位的重组蛋白抗原。为提高HCMV抗体检测的敏感性、特异性和准确性,推荐用双表位或多表位的重组蛋白试剂盒来诊断HCMV感染。HCMV被膜磷蛋白pp65表明有T细胞和B细胞表位,可诱导中和抗体的产生。我们试图通过基因重组技术制备HCMV pp65重组蛋白,并将其用作HCMV感染的诊断抗原。 研究目的：通过基因重组制备HCMV pp65重组蛋白,并将其用于人巨细胞病毒感染的免疫学诊断。‘ 研究方法：根据GenBank中公布的HCMV PP65基因序列,自行设计一对引物,PCR扩增目的基因片段,然后对纯化的PCR产物及pGEX-4T-l载体质粒用EcoRI和BamHI两种限制性核酸内切酶进行双酶切并纯化回收,连接回收产物,构建pGEX-4T-1/PP65重组质粒,对重组质粒进行鉴定。将pGEX-4T-1/PP65重组质粒转化宿主大肠杆菌BL21(DE3),而后用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测验证其表达产物后,用亲和层析技术对上清中的融合蛋白进行纯化,用ELISA间接法对已纯化的GST/pp65融合蛋白的特性进行鉴定。纯化的GST/pp65用做ELISA诊断抗原检测423例人血清,并与商品试剂盒做了比较。 研究结果：通过PCR成功扩增PP65基因；成功构建重组质粒pGEX-4T-1/PP65;成功表达GST/pp65重组蛋白；GST/pp65重组蛋白与HCMV抗体结合的特异性较好。 研究结论：GST/pp65重组蛋白能用作HCMV诊断抗原。
【关键词】：人巨细胞病毒 GST/pp65重组蛋白 克隆 表达 纯化 ELISA
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要2-3
• Abstract3-8
• 符号说明8-10
• 综述10-17
• 参考文献14-17
• 前言17-19
• 参考文献17-19
• 第一部分 PP65基因克隆与原核表达载体的构建19-35
• 材料与方法19-33
• 1.材料19-22
• 1.1 毒株、菌株及载体19-20
• 1.2 试剂与设备20
• 1.3 引物合成与DNA测序20
• 1.4 主要仪器设备20
• 1.5 试剂盒20
• 1.6 主要试剂配方20-22
• 2.方法22-28
• 2.1 HCMV病毒的收集22-23
• 2.1.1 HELF细胞的复苏与传代22
• 2.1.2 HCMV病毒的培养22-23
• 2.2 HCMV病毒DNA模板的提取23
• 2.3 pGEX-4T-1/PP65重组质粒的构建23-26
• 2.3.1 人巨细胞病毒表面抗原PP65基因的PCR扩增23-24
• 2.3.2 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳24
• 2.3.3 pGEX-4T-1载体质粒DNA的提取24-25
• 2.3.4 PCR纯化产物与载体质粒DNA的双酶切及纯化回收25-26
• 2.3.5 PP65和pGEX-4T-1的连接26
• 2.4 重组质粒pGEX-4T-1/PP65的转化26-27
• 2.4.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备26-27
• 2.4.2 重组质粒转化大肠杆菌27
• 2.5 pGEX-4T-1/PP65重组质粒的鉴定27-28
• 2.5.1 pGEX-4T-1/PP65重组质粒DNA的提取27
• 2.5.2 重组质粒的PCR与双酶切鉴定27-28
• 2.5.3 pGEX-4T-1/PP65重组质粒DNA的测序鉴定28
• 2.5.4 pGEX-4T-1/PP65重组质粒的保种28
• 3.结果28-33
• 3.1 正常的HELF细胞与产生细胞病变效应的HELF细胞28-29
• 3.2 PCR扩增PP65目的基因片段29-30
• 3.3 重组质粒的构建30-31
• 3.4 原核表达载体pGEX-4T-1/PP65的鉴定31-32
• 3.5 重组质粒测序鉴定32
• 3.6 目的氨基酸序列的抗原性预测32-33
• 4.讨论33
• 参考文献33-35
• 第二部分 pp65蛋白的可溶性表达及鉴定35-51
• 1.材料35-38
• 1.1 生物材料及来源35
• 1.2 生化试剂及部分配制方法35-38
• 1.3 主要仪器设备38
• 1.4 试剂盒38
• 2.方法38-43
• 2.1 重组质粒转化入宿主菌38-39
• 2.1.1 大肠杆菌BL21(DE3)感受态的制备38-39
• 2.1.2 pGEX-4T-1/PP65重组质粒转化入宿主菌39
• 2.1.3 pGEX-4T-1载体质粒转化入宿主菌39
• 2.2 pGEX-4T-1/PP65重组质粒的诱导表达39-40
• 2.2.1 少量诱导39
• 2.2.2 大量诱导39-40
• 2.3 表达产物的SDS-PAGE检测40
• 2.3.1 样品的处理40
• 2.3.2 SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制40
• 2.3.3 电泳检测40
• 2.4 表达产物的定位40-41
• 2.5 表达产物的GST蛋白纯化柱纯化41
• 2.6 间接ELISA法检测GST/pp65融合蛋白活性41-42
• 2.7 Western Blot检测GST/pp65融合蛋白活性42-43
• 2.8 GST/pp65蛋白和GST/gB蛋白混合抗原的特性鉴定43
• 3.结果43-49
• 3.1 蛋白诱导表达产物的SDS-PAGE电泳检测43-45
• 3.1.1 少量诱导SDS-PAGE电泳检测43-44
• 3.1.2 大量诱导SDS-PAGE电泳44-45
• 3.2 表达产物的纯化45-46
• 3.3 GST/pp65融合蛋白和GST蛋白的特性鉴定46-48
• 3.4 GST/pp65蛋白和GST/gB蛋白混合抗原的特性鉴定48-49
• 3.5 GST/pp65蛋白的Western Blot结果49
• 4.讨论49-50
• 参考文献50-51
• 第三部分 pp65ELISA试剂盒的初步应用51-55
• 1.血清与材料51
• 2.方法51-52
• 2.1 自制pp65 ELISA试剂盒51
• 2.2 自制pp65+gB ELISA试剂盒51
• 2.3 临床检测51-52
• 2.4 自制试剂盒特异性检测52
• 3.试验结果52-53
• 4.讨论53
• 参考文献53-55
• 致谢55-56

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 丁华;黄丽萍;刘和录;韩杰辉;梁巧玲;於艳霞;;孕妇及其新生儿感染HCMV-IgG、IgM的检测分析[J];中国优生与遗传杂志;2009年05期

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本文编号：409729