布拉酵母预防肠炎沙门氏菌感染的机制研究及其碱性磷酸酶的重组表达与性质分析

发布时间：2017-05-31 18:08

  本文关键词：布拉酵母预防肠炎沙门氏菌感染的机制研究及其碱性磷酸酶的重组表达与性质分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：布拉酵母在临床上主要用于防治大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、难辨梭菌、幽门螺杆菌、白假丝酵母和原虫等病原体感染引起的疾病。同时,布拉酵母分泌的碱性磷酸酶(AP)能够对革兰氏阴性菌LPS去磷酸化,而阻断由LPS介导的下游信号通路。本研究一方面研究布拉酵母预防肠炎沙门氏菌感染的机理。另一方面克隆布拉酵母碱性磷酸酶(SBAP)基因,并实现其在毕赤酵母中重组分泌表达,初步研究rAP对LPS去磷酸化作用,为该蛋白药物治疗LPS所致的疾病提供基础。 1)为了探讨布拉酵母预防肠炎沙门氏菌感染的机理,构建经布拉酵母预处理的小鼠肠炎沙门氏菌感染模型。在感染后监测小鼠体重变化及肠炎沙门氏菌在肝脏和盲肠中的数量,扫描电镜观察布拉酵母对肠道微生物的吸附作用,HE染色观察小鼠肝组织损伤情况。结果表明,感染后第11天,布拉酵母缓解由肠炎沙门氏菌感染所致的小鼠体重下降的现象(25.9g：22.3g)(p0.05)。在盲肠定植的肠炎沙门氏菌数由107cfu/g降低为105cfu/g,其在肝脏的数量由104cfu/g降低为4×102cfu/g。肝组织HE染色结果表明,布拉酵母能够缓解由肠炎沙门氏菌感染所引起的中性粒细胞、淋巴细胞和浆细胞浸润肝细胞所造成的肝损伤。 2)本试验通过酵母属AP蛋白序列相似性比对,据得到保守位点设计兼并引物,克隆SBAP基因。构建毕赤酵母甲醇诱导型表达载体pPICSAP,电转毕赤酵母X-33,将筛选后表达重组AP(rAP)的重组酵母在200ml摇瓶水平放大诱导表达,其发酵液上清用HisTrapHP柱纯化。结果表明,成功克隆SBAP基因,其大小为1701bp,无内含子,包含一个终止密码子,GenBank编号为KF471017。 pPICSAP重组表达菌株在200ml摇瓶水平诱导表达120h时,rAP的浓度达到最大值为43.66mg/1.纯化过程中确定洗脱缓冲液中咪唑最适浓度为250mM,洗脱峰经SDS-PAGE凝胶电泳和Bandscale软件分析,呈单一条带,其纯度达到90%以上。 3)本试验初步测定在二乙醇胺缓冲液中,Mg2+、EDTA、温度和pH对rAP酶活性的影响,及在最佳酶活条件下测定rAP的比活。同时,在pH2-10的Tris-HCl缓冲液中,体外检测rAP对LPS去磷酸化功效,及腹腔注射经rAP去磷酸化后的LPS对小鼠血清中TNF-α表达水平的影响。结果表明,在二乙醇胺缓冲液中,rAP的最佳反应条件是pH9.6,2mM Mg2+,温度为60℃,且EDTA为rAP的强抑制剂,1mM的EDTA将rAP的酶活抑制到其活性的18.37%。rAP比活为9912U/mg,是先前研究中重组表达的小牛肠AP比活的3倍。rAP温度稳定性分析显示其在37℃处理1h后,其酶活性仍维持在80%以上,但随着温度提高,酶活性逐渐降低,在100℃处理1h后,酶活性基本丧失。此外,在pH2-10的Tris-HCl缓冲液中,rAP对LPS均具有去磷酸化活性。经rAP去磷酸化后的LPS与野生型的LPS相比,显著减少了小鼠血清中TNF-α表达水平(55.16ng/1比64.24ng/1),(p0.01)。 综上,布拉酵母能缓解肠炎沙门氏菌感染小鼠肝脏诱导的肝损伤。同时,本研究首次报道并克隆SBAP基因,实现其在毕赤酵母中高活性分泌表达,建立rAP的Ni亲和层析柱一步纯化法,且rAP对LPS具有解毒功能。本研究获得的rAP将为治疗LPS所致的疾病提供有效的候选生物材料。
【关键词】：布拉酵母 肠炎沙门氏菌 毕赤酵母 rAP 酶学性质 LPS TNF-α
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要2-4
• Abstract4-7
• 符号说明7-8
• 第一章 综述8-20
• 1.1 布拉酵母概述8
• 1.2 布拉酵母益生机理研究进展8-13
• 1.3 布拉酵母在疾病防治中的应用研究进展13-17
• 1.4 布拉酵母在饲料添加剂领域中的研究进展17-20
• 第二章 布拉酵母预防肠炎沙门氏菌感染的机制研究20-30
• 2.1 引言20
• 2.2 试验材料20-22
• 2.3 方法22-24
• 2.4 结果24-28
• 2.5 讨论28-30
• 第三章 布拉酵母碱性磷酸酶基因克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达与纯化30-61
• 3.1 引言30-31
• 3.2 试验材料31-36
• 3.3 方法36-50
• 3.4 结果50-59
• 3.5 讨论59-61
• 第四章 rAP性质分析61-69
• 4.1 引言61
• 4.2 试验材料61-62
• 4.3 试验方法62-65
• 4.4 结果65-68
• 4.5 讨论68-69
• 参考文献69-82
• 致谢82-83
• 硕士期间发表的学术论文83-84

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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  本文关键词：布拉酵母预防肠炎沙门氏菌感染的机制研究及其碱性磷酸酶的重组表达与性质分析，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：410235