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MUC2基因表达与益生菌抑制大肠杆菌K1株黏附侵袭肠上皮细胞的关系研究

发布时间:2017-06-02 01:05

  本文关键词:MUC2基因表达与益生菌抑制大肠杆菌K1株黏附侵袭肠上皮细胞的关系研究,由笔耕文化传播整理发布。


【摘要】:一、研究背景 黏蛋白(Mucin)是由体内多种上皮细胞分泌的大分子量糖蛋白。根据其结构的不同可分为分泌型和膜结合型。在正常情况下,黏蛋白除了对上皮细胞组织起保护作用外,还参与上皮细胞的分类和更新,细胞黏附和细胞信号传导通路的调节等。在病理状态下,黏蛋白在恶性肿瘤及癌病变中的表达发生异常。MUC2属于分泌型黏蛋白,在结肠、小肠及呼吸道上皮细胞中均有表达。该蛋白质在肠道的表面形成一层粘液层发挥润滑和拮抗致病菌的肠道黏附和侵袭的作用。在正常情况下,MUC2100%表达于肠道粘膜上皮,而在大肠肿瘤中表达降低。目前已在多种上皮来源的肿瘤及肠道疾病中发现黏蛋白的结构及功能发生改变,出现黏蛋白的异常表达,其异常表达与临床预后相关。Ho等研究显示MUC2的异常表达与其启动子高甲基化相关,并且已有研究显示在结直肠癌细胞中MUC2mRNA的表达受抑制,其发生机制与MUC2基因启动子区CpG岛高甲基化相关。 细菌性脑膜炎是新生儿时期中枢神经系统最常见最严重的感染。其中大肠埃希菌(E. coli) K1株是目前新生儿细菌性脑膜炎的首要致病菌.E. coli K1株在40%败血症或80%脑膜炎患儿中都可分离到,它主要源于母亲肠道,孕妇因其特殊体质,肠道定殖的E. coli K1株容易易位于阴道,致使新生儿在通过产道时获得感染。E. coli K1株一旦定植于新生儿肠道,0.5%可发生肠道侵袭性定位转移而入血,并穿过血脑屏障而引发脑膜炎。所以调节肠道微生态平衡,抑制致病菌的肠道黏附侵袭,成为在孕妇阶段预防本病发生的关键步骤。另外,新生儿脑膜炎的发生过程中,E. coli K1株首先定植于新生儿肠道,之后才会穿透肠屏障和血脑屏障,引起菌血症和脑膜炎,所以预防E. coli K1株株穿透肠上皮入血,也成为有效预防其引发菌血症和脑膜炎的关键环节。抗生素广泛应用于感染性疾病的治疗,细菌性脑膜炎仍然是新生儿高发病率和高死亡率的重要原因之一。各种抗生素的广泛长期应用,一方面使耐药菌株增加,耐药因子迅速扩散,另一方面引起肠道菌群絮乱,造成肠道功能失调。 益生菌是一类对宿主有益的活性微生物,是定植于人体肠道、生殖系统内,能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。益生菌对维持肠道微生态稳定、降低胃肠道疾病的发病率、抑制病原微生物侵袭、对腹泻疾病的预防、调节免疫防御方面有重要作用。体外研究证实,益生菌制剂抑制病原微生物黏附肠道上皮细胞,抑制作用是通过增加肠道黏液素MUC2、MUC3的表达为媒介。细菌上皮细胞黏附是多步骤的,首先是细菌与上皮细胞层的作用。益生菌通过加强肠内黏液素的产生来阻止肠道病原菌的附着,附着能被抑制是空间障碍或者黏液素模仿上皮细胞的细菌结合位点而产生的竞争抑制.R.Mack等证实黏蛋白由肠上皮细胞分泌,阻挡致病蛋白EPEC接触肠上皮细胞,避免EPEC黏附到肠上皮细胞。肠道黏液层的主要成分黏蛋白是一种高分子量的糖蛋白通过上皮细胞的许多器官合成和分泌的,其有调节免疫、保护肠道和预防致病菌损伤的作用。在不同黏蛋白基因中,MUC2是主要的回结肠黏蛋白,在小肠和大肠的杯状细胞中表达,是结肠的主要分泌黏蛋白成分。肠道病原菌拥有了很多战略来回避黏蛋白叠加上皮细胞。黏蛋白-病原体相互作用可能由上皮细胞黏蛋白的数量和质量决定的。 目前对益生菌、致病菌和肠道黏蛋白基因表达之间的关系研究较少。MUC2在致病菌侵袭肠屏障中的作用机理仍不清楚。本研究通过构建MUC2shRNA真核质粒表达载体,利用脂质体LipofectamineTM2000转染人结肠癌Caco-2细胞干扰MUC2基因表达,以了解黏蛋白MUC2基因沉默与E. coliK1株E44黏附侵袭肠屏障之间的关系;另一方面,通过去甲基化制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)预先处理Caco-2细胞,探讨去甲基化制剂5-Aza-CdR诱导高甲基化失活的MUC2基因重新表达的可能性及其对大肠杆菌E44株黏附侵袭肠上皮细胞的影响,初步鉴定5-Aza-CdR与益生菌之间的作用关系,以了解益生菌和5-Aza-CdR在E. coli Kl株E44侵袭肠屏障中的具体机制,为研究MUC2基因在益生菌拮抗致病菌黏附侵袭肠上皮细胞中的作用及机制打下基础。 二、研究方法 1、MUC2shRNA真核质粒表达载体的构建与鉴定 为了探讨黏蛋白MUC2基因沉默与三联活菌片中益生菌抑制大肠杆菌K1株E44黏附侵袭肠上皮作用之间的关系,设计合成4个靶向MUC2基因的可干扰序列,并设计一条经BLAST检索与现有基因文库中所有人源基因均无同源性的非特异性序列为阴性对照序列。将合成的DNAOligo稀释后退火形成shRNA双链DNA,与pGPU6/GFP/Neo质粒分别用Bbs Ⅰ、BamH I双酶切后,以T4DNA连接酶进行连接,连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,筛选后抽提质粒,进行酶切和测序鉴定。 2、重组质粒瞬时转染人结肠癌Caco-2细胞 取测序正确的重组质粒1.6gg和4.0μL脂质体LipofectamineTM2000分别稀释于100μLOpti-MEM中,室温静置5min;然后将两者混合,室温再放置20min,均匀加入培养孔内6h后,更换含10%胎牛血清的DMEM培养基。48h后,在倒置荧光显微镜下观察转染细胞的绿色荧光情况,预测重组干扰质粒转染Caco-2细胞的效率。 3、荧光定量PCR检测MUC2基因干扰效率并筛选最有效的干扰序列 细胞转染48h后,收集细胞,Trizol法抽提细胞总RNA。取2μg总RNA进行逆转录后进行PCR反应,β-actin为内参。实验重复3次,通过2-△△Ct计算MUC2基因的相对表达量,以Caco-2细胞为对照细胞。根据荧光实时定量PCR结果,筛选出最有效抑制MUC2基因表达的干扰质粒并用于后续实验。 4、MUC2基因干扰后竞争性排斥法检测益生菌对E. coli K1株黏附侵袭Caco-2细胞的影响 黏附和侵袭实验采用竞争性排除法,将人结肠癌Caco-2细胞株接种于24孔板中,细胞密度达80%~90%,用灭菌的PBS漂洗2次。黏附侵袭实验步骤如前研究所述:每孔加108CFU益生菌与107CFU E44株共同孵育2.5h,对照组用等体积培养基代替益生菌与等量致病菌共同孵育。用培养基轻轻漂洗细胞3次,黏附实验每孔加0.5%TritonX-100200μL,孵育8min裂解细胞,加入蒸馏水250gL,连续多次吹打并吸出样品,倍比稀释后涂布含利福平的琼脂平板24h后计数菌落数,实验重复三次。侵袭实验先用培养基(含庆大霉素终浓度为100μg/mL)孵育1h,以杀死细胞外细菌,之后实验步骤按照黏附实验的操作步骤,倍比稀释后涂布含利福平的琼脂平板24h后计数菌落数,实验重复三次。 5、去甲基化制剂5-Aza-CdR处理Caco-2细胞后MUC2基因的表达情况 去甲基化制剂5-Aza-CdR作用Caco-2细胞72h后,不同处理组细胞分别与益生菌、大肠杆菌E44孵育。收集各组不同处理的Caco-2细胞,用Trizol试剂提取各组细胞总RNA,该实验操作按照Invitrogen/Trizol试剂盒说明书进行。紫外分光光度仪测定纯度,A260/A280比值在1.80~1.90之间。取2μg总RNA进行逆转录后进行荧光定量PCR反应,β-actin为内参。每组重复3次,通过2-△△ct表示MUC2的相对表达量,以Caco-2细胞为对照细胞。 6、竞争性排斥方法检测去甲基化制剂5-Aza-CdR对大肠杆菌E44黏附侵袭肠上皮的影响 实验采用竞争性排除法,将人结肠癌Caco-2细胞株接种于24孔板中,细胞密度达70%-80%,将去甲基化制剂5-Aza-CdR按5×10-6mol/L的浓度配制的培养液加到5-Aza-CdR+E44组、5-Aza-CdR+益生菌+E44组相应培养孔中,分别在24h及48h后更换相同浓度的5-Aza-CdR培养液。以未加5-Aza-CdR干预的细胞为对照组,用等体积培养基代替5-Aza-CdR培养液,每组3个复孔。用灭菌的PBS漂洗2次。黏附实验:每孔加108CFU益生菌与107CFUE44株到5-Aza-CdR+益生菌+E44组、益生菌+E44组中共同孵育2.5h,其他组用等体积培养基代替与等量致病菌共同孵育。侵袭实验:每孔加108CFU的益生菌与107CFU E44株到5-Aza-CdR+益生菌+E44组、益生菌+E44组中共同孵育2.5h,其他组用等体积培养基代替与等量致病菌共同孵育。黏附侵袭实验步骤如前研究所述。实验重复3次。 三、结果 1、重组真核质粒表达载体酶切鉴定和DNA测序结果 挑选单克隆菌株,接种到含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中,震荡过夜,按质粒小量抽提步骤抽提质粒,所得质粒用BamH I、Pst I分别酶切鉴定。阳性重组质粒应该可以被BamH I切开,而不能被Pst Ⅰ切开。单酶切结果显示,所有重组体均为阳性重组质粒,从每组平板中挑选两个典型克隆进行测序鉴定。经引物测序后,测序结果和设计的shRNA碱基序列完全一致,证明该退火后合成的片段已经完整的插入了质粒之中而且没有单个碱基的突变,成功的构建了实验所需要的重组质粒。 2、脂质体介导法转染Caco-2细胞并间接估计转染效率 脂质体法RNAi MUC2质粒转染Caco-2细胞24h后,荧光显微镜下观察绿色荧光数,通过计数同一视野光镜下细胞总数及荧光显微镜下带有绿色荧光细胞个数,计算带有绿色荧光细胞的百分比,即转染效率=(绿色荧光细胞数/总细胞数)×100%。本实验转染效率约为75%-85%。 3、 MUC2基因mRNA表达的变化 重组质粒(RNAi MUC2)转染Caco-2细胞48h后,提取细胞总RNA进行检测,其对Caco-2细胞中MUC2mRNA的抑制情况如RT-qPCR结果显示。通过相对定量方法2-△△Ct来检测MUC2基因的干扰效率。 在设置的六组试验中,RNAi MUC2-1-4实验组的MUC2基因相对表达率分别为0.38、0.59、1.08、0.46,与空白组(Mock Control)比较,RNAi MUC2-1、RNAiMUC2-4有显著差异,其干扰效率为62%和54%;阴性对照组RNAi NC的MUC2基因相对表达率与空白对照组相比无统计学差异。在以后的实验中将选用RNAiMUC2-1质粒进行靶向MUC2基因功能抑制。 4、MUC2基因沉默后,益生菌对大肠杆菌E44黏附侵袭肠上皮细胞的抑制作用 采用竞争排斥实验方法来检测MUC2基因干扰前后益生菌干扰E44黏附侵袭Caco-2细胞的效果。以干扰前E44黏附侵袭率作为100%,以此标化益生菌共同孵育时E44的相对黏附侵袭率,MUC2基因干扰前,益生菌明显抑制致病菌黏附侵袭Caco-2细胞(P0.01),E44相对黏附率为14.36%,E44相对侵袭率为22.55%;MUC2基因干扰后,加益生菌共同孵育组与E44组相比,E44对肠上皮的黏附侵袭作用明显提高,E44相对粘附率为63.64%,E44相对侵袭率为70.33%。细菌黏附侵袭实验证明干扰MUC2基因后益生菌抑制E44黏附侵袭Caco-2细胞的作用显著降低(P0.01)。 5、去甲基化制剂5-Aza-CdR处理前后MUC2基因mRNA的表达 结肠癌细胞系Caco-2细胞经5×10-6mol/L5-Aza-CdR处理后,MUC2基因的mRNA重新表达(P0.01),结果与益生菌组一致,E44组MUC2基因表达较对照组明显降低(P0.01),而5-Aza-CdR+E44组、5-Aza-CdR+益生菌+E44组、益生菌+E44组与对照组相比没有明显差异。 6、去甲基化制剂5-Aza-CdR对大肠杆菌E44黏附侵袭Caco-2细胞的影响 加去甲基化制剂5-Aza-CdR处理Caco-2细胞72h后,采用竞争性排斥法将益生菌、大肠杆菌E44株与Caco-2细胞共孵育,检测去甲基化制剂5-Aza-CdR和益生菌拮抗大肠杆菌E44株黏附侵袭Caco-2细胞的效果。以对照组E44黏附侵袭率作为100%,以此标化5-Aza-CdR处理组和益生菌共同孵育组E44的相对黏附侵袭率,加去甲基化制剂5-Aza-CdR处理后,明显降低致病菌E44黏附侵袭Caco-2细胞(P0.05),E44相对黏附率为10.33%,E44相对侵袭率为29.45%;益生菌作用效果与5-Aza-CdR相似,与对照组相比,益生菌组E44相对黏附率为11.70%,相对侵袭率为33.43(P0.05)。 四、结论 1、shRNA真核质粒介导的RNA干扰可明显抑制Caco-2细胞MUC2基因的表达; 2、MUC2基因沉默后,益生菌对E44黏附侵袭肠上皮细胞的抑制作用明显降低; 3、去甲基化制剂5-Aza-CdR能够逆转MUC2基因甲基化状态,调控MUC2基因重新表达; 4、去甲基化制剂5-Aza-CdR能够有效抑制大肠杆菌E44株黏附侵袭肠上皮细胞,其作用效果与益生菌相似。
【关键词】:MUC2基因 RNA干扰 E. coli K1株E44 黏附与侵袭 5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR) DNA甲基化
【学位授予单位】:南方医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R378.2
【目录】:
  • 摘要3-10
  • ABSTRACT10-20
  • 前言20-24
  • 第一章 MUC2 shRNA真核质粒表达载体的构建与鉴定24-40
  • 1.1 材料25-28
  • 1.2 方法28-36
  • 1.3 结果36-38
  • 1.4 讨论38-40
  • 第二章 MUC2基因沉默与益生菌抑制E.coli K1株黏附侵袭肠上皮细胞的关系40-59
  • 2.1 材料41-43
  • 2.2 方法43-50
  • 2.3 结果50-56
  • 2.4 讨论56-59
  • 第三章 MUC2基因甲基化与益生菌抑制E.coli K1株黏附侵袭肠上皮细胞的关系59-70
  • 3.1 材料59-61
  • 3.2 方法61-64
  • 3.3 结果64-68
  • 3.4 讨论68-70
  • 全文总结70-73
  • 参考文献73-79
  • 英文缩略词表79-80
  • 攻读学位期间发表论文80-81
  • 致谢81-82

【参考文献】

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1 顾婷婷,乔继英,杨s,

本文编号:413870


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