Calpain2在梗阻性黄疸大鼠模型肝组织中的表达及中药的干预作用研究

发布时间：2017-06-03 09:17

  本文关键词：Calpain2在梗阻性黄疸大鼠模型肝组织中的表达及中药的干预作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 本研究通过建立梗阻性黄疸SD大鼠肝损害模型,观察梗阻性黄疸时calpain2在大鼠肝组织中的表达变化；探讨梗阻性黄疸术后中药茵陈蒿汤对肝脏的保护作用及与calpain2表达的关系,为临床围手术期合理应用中药提供理论依据。 方法： 选择成年SD大鼠160只体重(250-270)g,雄性,动物级别为清洁级,随机将大鼠分组：(1)假手术对照组(S组)40只；(2)梗阻性黄疸组(O组)40只；(3)梗阻性黄疸模型+中药组(OC组)40只；(4)梗阻性黄疸模型+生理盐水组(OW组)40只。四组分别于术后1、3、5、7D,每个时相点处死大鼠10只,留取血清及肝组织。检测血清中TBIL、ALT、AST等生化指标含量；另取肝组织固定于5%中性福尔马林溶液,石蜡包埋,5μmm切片行HE染色观察肝组织的病理改变,并免疫组化检测肝组织calpain2的表达；剩余肝组织经液氮速冻后置于-80℃冰箱,用western blot测肝组织中calpain2蛋白表达变化；用Real-Time PCR检测大鼠肝组织m-calpain基因表达量情况。 结果： 1.血清生化指标的变化：S组术后第1天ALT、AST轻度升高,后逐渐降低到正常值范围,差异无统计学意义；与S组比较,O组术后ALT、AST迅速增高,ALT迅速增高,并维持较高水平,之后逐渐下降(P0.05)。OC组与OW组ALT、AST均升高,且均在术后第一天达到最大值,之后逐渐降低。OC组在各个时相点ALT、AST的值均低于OW组。S组术后TBIL无明显变化,差异无统计学意义；与S组比较,O组梗阻后TBIL迅速增高,并于第3天达到峰值(P0.05),后缓慢下降。两组TBIL均升高明显,TBIL值术后迅速升高,并于第三天达到峰值,之后缓慢下降；OC组在各个时相点TBIL值均低于OW组。 2.肝组织病理学改变：S组肝细胞无肿胀、坏死,肝细胞索排列整齐。O组大鼠肝组织可见炎性细胞浸润,细小胆管和无管腔的小胆管增生,纤维组织细胞增生,肝细胞出现变性坏死。OW组术后1大见少量嗜中性粒细胞和淋巴细胞浸润；术后第3天肝小叶结构紊乱更加明显,甚至不能分辨小叶结构,肝细胞形态大小不,广泛变性,术后第5天,细胞形态大小不一,小叶内有明显的炎细胞浸润,门管区中度炎症,部分标本可见局灶性窦周纤维组织沉积形成纤维间隔。术后第7天肝细胞出现变性坏死发生率增加及程度加重,重者见片状出血和坏死。OC组术后病理改变与OW组基本一致,但病理改变程度上较OW组轻。 3.采用、vestern blot测肝组织中calpain2蛋白表达变化：在蛋白水平上,以GAPDH为内参,以S组为对照组,O组calpain2蛋白的含量与之比较,各时相点均出现明显差异(P0.05),O组calpain2蛋白表达水平高于S组。以OW组为对照组,OC组calpain2蛋白的含量与之比较,各时相点均出现明显差异(P0.05),OC组calpain2蛋白表达水平低于OW组。O组、OW组、OC组随着造模时间延长,calpain2蛋白表达均呈上升趋势。 4.免疫组化检测肝组织calpain2的表达：光镜下,正常组大鼠肝脏内表达较少的calpain2蛋白。随着造模时间的延长,O组、OW组、OC组calpain2蛋白阳性表达量逐渐增加,主要表达于肝细胞胞浆内,偶见在细胞核表达。与对照组比较P0.05。 5、Real-Time PCR检测大鼠肝组织m-calpain基因表达量情况：S组m-calpain基因表达水平随造模时间加长无明显变化。O组m-calpain基因表达水平随造模时间加长升高,O组与S组比较：O组n-calpain基因表达水平在各个时相点均高于S组(P0.05)。OW组、OC组m-calpain基因表达水平随造模时间加长升高,OC组与OW组比较：OC组m-calpain基因表达水平在各个时相点均低于OW组(P0.05)。 结论： 1.OJ时,随着造模时间的延长,calpain2蛋白及m-calpain基因表达水平呈逐渐增加趋势,表明在OJ大鼠模型中,存在ERS,且凋亡指数逐渐增加。 2.OJ大鼠给予中药茵陈蒿汤可以抑制calpain2蛋白的表达,减少因calpain2蛋白高表达引起的肝细胞损伤,改善肝脏因梗阻引起的肝功能异常。m-calpain基因表达水平与梗阻性黄疸肝损伤程度变化一致,提示m-calpain参与了内质网应激介导的梗阻性黄疸肝细胞凋亡发生与发展过程。临床治疗OJ患者可以辩证使用该方剂,促进术后肝脏功能恢复,降低并发症发生率。
【关键词】：大鼠 梗阻性黄疽 内质网应激 细胞凋亡 需钙蛋白酶-2 茵陈蒿汤
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R-332;R575
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 目录9-11
• 缩略语/符号说明11-12
• 前言12-15
• 研究现状、成果12-14
• 研究目的、方法14-15
• 第一部分 胆道梗阻后大鼠肝脏的calpain 2表达的实验研究15-36
• 1.1 对象和方法15-26
• 1.1.1 实验动物及分组15
• 1.1.2 动物造模15-16
• 1.1.3 标本的采集16
• 1.1.4 观察指标及方法16-26
• 1.2 结果26-32
• 1.2.1 大鼠一般状态的观察26-27
• 1.2.2 大鼠血清ALT、AST的含量27-28
• 1.2.3 大鼠血清总胆红素(TB1L)的含量28-29
• 1.2.4 光镜观察肝组织的病理改变29
• 1.2.5 Western blot肝组织calpain 2蛋白的表达结果29-30
• 1.2.6 免疫组化检测肝组织calpain 2蛋白的表达30-31
• 1.2.7 Real-Time PCR检测大鼠肝组织m-calpain基因表达结果31-32
• 1.3 讨论32-35
• 1.4 小结35-36
• 第二部分 茵陈蒿汤对胆道梗阻后大鼠肝脏calpain 2表达及肝功能影响的研究36-47
• 2.1 对象和方法36-37
• 2.1.1 实验动物及分组36
• 2.1.2 动物造模36
• 2.1.3 中药方剂36
• 2.1.4 标本的采集36
• 2.1.5 观察指标及方法36-37
• 2.2 结果37-42
• 2.2.1 大鼠一般状态的观察37
• 2.2.2 大鼠血清ALT、AST的含量37-39
• 2.2.3 大鼠血清总胆红索(TBIL)的含量39
• 2.2.4 光镜观察肝组织的病理改变39
• 2.2.5 Western blot肝组织calpain 2蛋白的表达结果39-40
• 2.2.6 免疫组化检测肝组织calpain 2蛋白的表达定量结果40-41
• 2.2.7 Real-Time PCR检测大鼠肝组织m-calpain基因表达结果41-42
• 2.3 讨论42-46
• 2.4 小结46-47
• 结论47-48
• 参考文献48-51
• 发表论文和参加科研情况说明51-52
• 附录52-56
• 综述 内质网应激在梗阻性黄疸肝细胞凋亡中的作用及中药的干预机制56-66
• 综述参考文献61-66
• 致谢66

【参考文献】

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本文编号：417784