人活性颗粒酶K重组蛋白的制备及其促炎作用机制研究

发布时间：2017-06-03 19:15

  本文关键词：人活性颗粒酶K重组蛋白的制备及其促炎作用机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：颗粒酶(Granzyme)是NK细胞和CTLs在杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞中发挥重要作用的一类丝氨酸蛋白酶。人颗粒酶包括颗粒酶A/B/K/M/H,各种颗粒酶通过作用于各自对应底物发挥生物功能。颗粒酶K(GzmK)是类胰蛋白酶家族成员之一,它通过切割特异底物蛋白或蛋白复合物介导caspase非依赖细胞凋亡。最近几年研究发现,除了细胞毒性作用,GzmK在流感病毒感染小鼠体内表达水平明显上调,表明其在机体抗病毒过程中具有重要作用。另外,在一些急性炎症患者体内发现颗粒酶K表达水平与急性炎症的发展有关,提示颗粒酶K可能参与炎症反应,但其如何参与炎症反应及其机制尚不太明确。因此,利用基因工程方法制备人活性GzmK重组蛋白并进一步研究其促炎作用机制具有重要意义。 首先,利用RT-PCR扩增得到人活性颗粒酶K基因片段,PCR产物经双酶切后插入到pET24a(+)载体质粒中构建原核表达质粒pET24a(+)-GzmK。重组质粒pET24a(+)-GzmK转化大肠杆菌DE3并利用IPGT诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE和western blot进行鉴定,结果表明人活性GzmK重组蛋白已在大肠杆菌中成功地进行了表达。 其次,对工程菌表达条件进行初步优化,在最优条件下表达人活性GzmK重组蛋白,并利用Ni2+柱亲和层析法对目的蛋白进行了纯化,其纯度可达90%以上。获得高纯度人活性GzmK重组蛋白后,利用丝氨酸酶检测试剂盒和westernblot分别对其酶活性进行测定,结果表明该重组蛋白具有较好的生物学活性。重组蛋白中的内毒素经内毒素吸收试剂盒去除。 最后,用人活性GzmK重组蛋白处理人单核细胞系THP-1,利用实时定量PCR和ELISA分别从mRNA水平和蛋白水平检测了THP-1分泌炎症因子的情况,结果表明GzmK可促进THP-1分泌炎症因子TNF-α、MCP-1、IL-8、IL-1β,并且具有浓度依赖性。利用western blot检测结果证明GzmK可能通过激活ERK1/2和p38MAPK信号通路促进炎症因子的分泌,且这种促炎作用可能是通过THP-1细胞上的蛋白酶激活受体1(PAR-1)介导的。 本研究利用基因工程的方法制备了具有生物学活性的人活性GzmK重组蛋白,并初步证明了GzmK可促进THP-1细胞分泌炎症因子及其可能的分子机制,该研究结果为阐明GzmK参与炎症反应提供实验依据,并进而以颗粒酶K为靶向进行抗炎症治疗奠定了一定的理论和实验基础。
【关键词】：颗粒酶K 原核表达 活性测定 促炎作用
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要6-7
• Abstract7-10
• 前言10-22
• 第一章 人活性GzmK基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达22-40
• 引言22-23
• 材料23-29
• 方法29-36
• 结果36-39
• 讨论39-40
• 第二章 人活性GzmK重组蛋白的纯化及活性鉴定40-58
• 引言40
• 材料40-45
• 方法45-50
• 结果50-56
• 讨论56-58
• 第三章 人活性GzmK重组蛋白促炎作用机制研究58-74
• 引言58
• 材料58-61
• 方法61-65
• 结果65-72
• 讨论72-74
• 结论74-75
• 附录75-76
• 参考文献76-83
• 综述83-92
• 参考文献89-92
• 致谢92

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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本文编号：419002