新型小分子免疫抑制剂艾拉莫德对人类树突状细胞分化成熟的影响

发布时间：2017-06-04 14:08

  本文关键词：新型小分子免疫抑制剂艾拉莫德对人类树突状细胞分化成熟的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：艾拉莫德(iguratimod，T-614)是用于治疗成人活动性类风湿关节炎的1类新药。前期功能研究提示它能抑制IFN-γ、IL-1、IL-6、TNF-a等细胞因子，免疫球蛋白(IgM、IgG)的产生并选择性抑制COX-2，可能通过NF-κB信号通路抑制和降低炎症反应。树突状细胞（Dendritic cells，DCs）能启动初始免疫应答、诱导免疫耐受，是治疗自身免疫性疾病的重要突破口。国内外暂未见艾拉莫德对DCs的功能的研究。本实验旨在探讨艾拉莫德对健康人外周血DCs的分化和成熟的影响。 方法：本课题采用密度梯度离心法（区带离心法）和贴壁法建立人类外周血单核细胞分化的DCs体外培养体系，采用噻唑蓝比色（MTT）法检测艾拉莫德不同浓度作用后对树突状细胞的存活率的影响，流式细胞术测定艾拉莫德作用后树突状细胞表面分子的表达。应用混合淋巴细胞反应（MLR）的方法检测受艾拉莫德作用后的树突状细胞对淋巴细胞的刺激增殖能力。进一步检测艾拉莫德对DCs分泌细胞因子IL-12的影响，验证艾拉莫德对DCs功能的作用。 结果： 1.倒置相差显微镜下观察树突状细胞的形态，iDCs大部分贴壁，表面突起较少细胞多呈现较小的圆形，可见大部分的细胞聚集贴壁。脂多糖刺激24h后再观察，细胞体积增大呈圆形或椭圆形，表面可见许多不规则树突状突起,大部分悬浮为典型的mDC形态。经流式细胞学检测，iDCs表面低表达CD86和CD83， CD86阳性数占10.7%、CD83占17.2%，而高表达HLA-DR和CD80，HLA-DR阳性数占89.8%、CD8092.1%，经LPS刺激24h后，iDCs向mDC发展，CD86阳性数占为78.7%、CD83占84.7%，较未成熟细胞的阳性细胞数明显增高。 2.不同浓度艾拉莫德（50ug/ml、100ug/ml、150ug/ml、200ug/、250ug/ml）作用于DCs细胞，经MTT法检测DCs的存活率80%。随着艾拉莫德浓度的增加作用于DCs，观察其形态与正常对照组相比，体积变小更圆，贴壁细胞增多，表面的树突较少，表明实验浓度作用下树突状细胞呈非成熟状态。艾拉莫德的浓度在200ug/ml、250ug/ml时作用于iDCs≥3h，再予LPS刺激细胞成熟，流式细胞仪检测树突状细胞表面分子，CD86阳性数占19.3%与16.0%，较正常成熟细胞的阳性数明显下降。与其他浓度组CD86的阳性数有显著性差异，与其他表面分子的阳性数也有显著性差异。 3.艾拉莫德浓度为50ug/ml作用于树突状细胞，3h后LPS刺激细胞成熟，再与同种异体淋巴细胞1：1混合培养，，其OD值最大为0.6536。同种试验方法，各个浓度组间、比例组间分别有极显著差异（p0.01）。不同浓度艾拉莫德作用于DCs后，在浓度为250ug/ml时树突状细胞分泌IL-12的表达量最低，为5.7pg/ml，在浓度为50ug/ml时最高，为222.3pg/ml。 结论： 1.艾拉莫德能够剂量依赖性的改变人类单核细胞来源的树突状细胞的形态。 2.艾拉莫德浓度为200ug/ml及250ug/ml时作用于树突状细胞的时间≥3h，树突状细胞表面受体CD86的表达明显下降，艾拉莫德对DCs表达CD86抑制作用。 3.树突状细胞与同种异体淋巴细胞混合培养，淋巴细胞的增殖能力与艾拉莫德的浓度相关。 4.艾拉莫德可呈剂量依赖性的抑制树突状细胞分泌IL-12。
【关键词】：树突状细胞 艾拉莫德 表面分子 IL-12
【学位授予单位】：泸州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 英汉缩略词对照表6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 第一章 前言12-15
• 第二章 DCs 的体外培养15-25
• 2.1 引言15
• 2.2 材料与设备15-16
• 2.2.1 实验材料15
• 2.2.2 实验试剂15-16
• 2.2.2.1 细胞培养实验试剂15-16
• 2.2.2.2 流式细胞检测试剂16
• 2.2.3 实验仪器及设备16
• 2.3 实验方法16-19
• 2.3.1 主要溶液配制16-17
• 2.3.1.1 rhGM-CSF 细胞因子分装16-17
• 2.3.1.2 rhIL-4 细胞因子分装17
• 2.3.1.3 LPS 分装17
• 2.3.1.4 10% FBS RPMI-1640 完全培养基的配制17
• 2.3.1.5 磷酸缓冲盐 PBS 的配制17
• 2.3.2 健康人外周血 DCs 的体外分离培养17-18
• 2.3.3 细胞的形态和表型鉴定18-19
• 2.3.3.1 细胞的形态观察18-19
• 2.3.3.2 DCs 表型的鉴定19
• 2.3.4 数据统计与分析19
• 2.4 实验结果与分析19-23
• 2.4.1 DCs 体外培养体系的建立19-23
• 2.4.1.1 正常 DCs 的形态观察19-20
• 2.4.1.2 正常树突状细胞表型分析20-23
• 2.5 本章小结与讨论23-25
• 第三章 艾拉莫德对树突状细胞的作用25-48
• 3.1 引言25-26
• 3.2 材料和设备26-27
• 3.2.1 实验材料26
• 3.2.2 实验试剂26-27
• 3.2.2.1 细胞培养实验试剂26
• 3.2.2.2 流式细胞检测试剂26
• 3.2.2.3 其他试剂26-27
• 3.2.2.4 实验仪器及设备27
• 3.3 实验方法27-33
• 3.3.1 主要溶液配制27-29
• 3.3.1.1 rhGM-CSF 细胞因子分装27-28
• 3.3.1.2 rhIL-4 细胞因子分装28
• 3.3.1.3 LPS 分装28
• 3.3.1.4 T-614 溶液28
• 3.3.1.5 DEX 溶液28
• 3.3.1.6 10% FBS RPMI-1640 完全培养基28
• 3.3.1.7 10% SDS 的配制28
• 3.3.1.8 MTT 溶液配制28-29
• 3.3.1.9 丝裂霉素 C 溶液的配制29
• 3.3.1.10 磷酸缓冲盐 PBS 的配制29
• 3.3.2 试验流程图29
• 3.3.3 MTT 法检测细胞的存活率29-30
• 3.3.4 艾拉莫德对 DCs 作用的测定30
• 3.3.4.1 细胞的形态观察30
• 3.3.4.2 细胞的表型鉴定30
• 3.3.5 混合淋巴细胞实验30-31
• 3.3.6 DCs 分泌细胞因子 IL-12 活力测定31-33
• 3.3.6.1 IL-12 ELISA 试剂盒试剂准备31-32
• 3.3.6.2 IL-12 活力测定步骤32-33
• 3.3.7 数据统计与分析33
• 3.4 结果与分析33-46
• 3.4.1 不同浓度艾拉莫德对 DCs 作用33-43
• 3.4.1.1 MTT 法检测细胞活性34-35
• 3.4.1.2 不同浓度艾拉莫德及地塞米松作用后 DCs 的形态学观察35-36
• 3.4.1.3 不同浓度艾拉莫德对细胞的表型的影响36-43
• 3.4.2 混合淋巴细胞反应43-46
• 3.4.2.1 艾拉莫德作用后 DCs 刺激淋巴细胞的增殖的能力43-44
• 3.4.2.2 ELISA 试剂盒检测细胞上清 IL-12 含量44-46
• 3.5 本章小结46-48
• 第四章 结论与展望48-49
• 4.1 结论48
• 4.2 展望48-49
• 参考文献49-53
• 附录53-63
• 综述53-63
• 参考文献60-63
• 致谢63-64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 舒强;李兴福;侯怀水;李栋;刘花香;;艾拉莫德对骨关节炎滑膜成纤维样细胞特性的影响[J];中华风湿病学杂志;2006年07期

2 滕佳临;吕良敬;鲍春德;韩星海;孙凌云;徐建华;李兴福;吴华香;;艾拉莫德治疗类风湿关节炎多中心随机双盲安慰剂对照研究[J];中华风湿病学杂志;2007年08期

3 叶伟胜;张铁良;;类风湿关节炎流行病学进展[J];国际骨科学杂志;2009年03期

4 唐军民;张薇;;树突状细胞[J];解剖学报;1993年03期

5 张静;袁玉;李健华;王源园;刘广余;;艾拉莫德片在中国健康志愿者体内的药动学[J];中国临床药学杂志;2007年04期

6 舒强;李兴福;刘花香;李栋;;类风湿关节炎滑膜成纤维样细胞增殖特性的体外研究[J];山东大学学报(医学版);2006年11期

7 焦志军;王文红;李晶;陈蕾;尤海燕;汪毅;周光炎;;类风湿关节炎患者外周血单个核细胞Notch及其配体表达[J];现代免疫学;2007年06期

8 李幼平;树突状细胞与移植免疫耐受研究进展[J];生物医学工程学杂志;1997年04期

9 陈蕴颖,步宏;树突状细胞的表面标志及其免疫学意义[J];生物医学工程学杂志;1998年04期

10 高佩芳;姚茹冰;蔡辉;;树突状细胞在类风湿关节炎免疫耐受治疗中的作用[J];现代医学;2009年04期

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本文编号：421195