柴胡皂苷a人工抗原合成及其单克隆抗体的制备

发布时间：2017-06-07 14:14

  本文关键词：柴胡皂苷a人工抗原合成及其单克隆抗体的制备，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：柴胡皂苷a是柴胡或狭叶柴胡的主要活性成分。柴胡是一种常用的传统中药,对其有效成分的分析有利于我们研究柴胡的药理作用,而柴胡皂苷的含量分析是药理作用研究中很重要的一部分,传统的分析检测方法如HPLC都需要比较麻烦的前处理过程。与这些常规方法相比,免疫分析方法具有选择性高、灵敏度高和特异性强等特点,在中药现代化研究中具有其特有的优势。 目的： 用高碘酸钠法合成柴胡皂苷a的人工抗原并进行鉴定,通过免疫小鼠制备抗柴胡皂苷a的单克隆抗体,建立三萜皂苷类化合物的免疫分析法,对柴胡皂苷a进行定性和定量分析,为含柴胡皂苷a药物及复方的质量控制、体内作用等研究提供一种技术手段。 方法： 利用高碘算钠法氧化柴胡皂苷a,在碱性条件下与载体蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、多聚赖氨酸(PLL)偶联成人工抗原。考察各种影响人工抗原合成的条件。用紫外分光光度法、薄层色谱法和小鼠免疫反应对合成的抗原进行鉴定。 将柴胡皂苷a (SSa)、SSa-BSA、SSa-PLL、BSA、PLL用薄层色谱法进行检测,用乙酸乙酯-甲醇-水(8：2：1)为展开剂进行展开,结束后晾干,用10%硫酸-乙醇溶液显色。 用合成的人工抗原免疫Balb/C小鼠。按100μg/只的剂量取人工抗原,与等体积弗氏佐剂乳化均匀后皮下多点和腹腔注射,经过初次免疫和4次加强免疫后,尾尖取血,间接ELISA检测抗血清的效价,评价人工抗原的免疫原性；间接竞争ELISA检测抗血清的特异性。 取免疫小鼠的脾细胞,用PEG法与SP2/0细胞融合,最终获得能稳定分泌抗柴胡皂苷a抗体的杂交瘤细胞,采用腹水法大量制备抗柴胡皂苷a的单克隆抗体。 用生产的单克隆抗体建立柴胡皂苷a的免疫分析方法,检测该抗体的特异性、敏感性以及与其他中药活性成分的交叉反应率。 结果： 通过上述方法,本实验合成了可用于免疫的柴胡皂苷a的人工抗原,经鉴定,人工抗原偶联成功。免疫小鼠后得到的抗血清,间接ELISA检测效价最高达1：80000。通过细胞融合和筛选,得到了单克隆细胞株并进行抗体的生产。通过对单抗的鉴定,其检测范围为1μg/mL-500μg/mL。 结论： 在人工抗原的鉴定方面,薄层色谱法具有很好的优势,操作简单,节省时间,检测结果比较准确。 利用柴胡皂苷a抗体建立的免疫分析方法可对含柴胡皂苷a的复方、汤剂等进行定量检测：还可以对血清、组织等生物样品中的柴胡皂苷a进行定性和定量分析,研究柴胡皂苷a在生物体内的分布和作用。
【关键词】：ELISA 柴胡皂苷a 单克隆抗体 人工抗原
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R284;R392
【目录】：

• 中文摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 缩略语表12-14
• 文献综述14-26
• 1 柴胡与柴胡皂苷a14-15
• 1.1 柴胡14
• 1.2 柴胡皂苷a14-15
• 2 柴胡常用的分析检测方法15
• 3 免疫分析方法15-26
• 3.1 人工抗原合成16-20
• 3.1.1 高碘酸钠法17
• 3.1.2 碳二亚胺法17-18
• 3.1.3 混合酸酐法18-19
• 3.1.4 重氮化法19
• 3.1.5 活泼酯法19
• 3.1.6 戊二醛法19
• 3.1.7 其他方法19-20
• 3.2 免疫分析方法的应用20-26
• 3.2.1 免疫亲和色谱柱21-23
• 3.2.2 蛋白质印记法23
• 3.2.3 胶体金法23-26
• 前言26-28
• 材料与方法28-42
• 1 实验材料28-33
• 1.1 实验动物28
• 1.2 实验耗材和试剂28-29
• 1.3 主要仪器29-31
• 1.4 常用溶液及培养基配置31-33
• 2 实验方法33-42
• 2.1 高碘酸钠法合成SSa人工抗原33-34
• 2.2 SSa人工抗原的鉴定34-35
• 2.2.1 紫外扫描法34
• 2.2.2 薄层色谱法34-35
• 2.3 动物免疫35
• 2.4 间接ELISA法测定血清中抗体的效价35-36
• 2.5 间接竞争ELISA法测定抗血清中抗体的特异性36
• 2.6 细胞融合36-37
• 2.7 杂交瘤细胞的筛选及克隆化37-38
• 2.8 腹水诱导38
• 2.9 腹水纯化及鉴定38-40
• 2.10 用间接竞争ELISA法绘制抑制率曲线和标准曲线40
• 2.11 交叉反应40-42
• 实验结果42-52
• 1 人工抗原合成实验方案的优化42
• 2 SSa-BSA的紫外检测结果42-43
• 3 SSa-BSA和SSa-PLL的薄层色谱图43-44
• 4 动物免疫实验结果44-46
• 4.1 间接ELISA法检测抗血清效价44-45
• 4.2 间接竞争ELISA法测定抗血清中抗体的特异性45-46
• 5 柴胡皂苷a单抗制备结果46-52
• 5.1 细胞融合结果46
• 5.2 克隆化结果46-47
• 5.3 腹水诱导和纯化结果47
• 5.4 标准曲线法测定腹水的抑制率47-49
• 5.5 交叉反应率结果49-52
• 讨论52-58
• 1 人工抗原制备52-53
• 2 人工抗原的鉴定53-54
• 3 动物实验54
• 4 单克隆抗体的制备54-55
• 5 腹水制备和纯化55
• 6 单抗特异性鉴定55-56
• 7 应用前景56
• 8 单克隆抗体在应用时的注意事项56-58
• 参考文献58-64
• 致谢64-66
• 个人简历66

【参考文献】

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本文编号：429296