人巨细胞病毒通过NF-κB信号途径诱导人星形胶质细胞表达IL-6和IL-8

发布时间：2017-09-08 05:51

  本文关键词：人巨细胞病毒通过NF-κB信号途径诱导人星形胶质细胞表达IL-6和IL-8

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【摘要】：目的： 1.观察人巨细胞病毒(human cytomegalo virus, HCMV)感染对人原代星形胶质细胞IL-6和IL-8的表达变化。 2.探讨核因子κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB)在HCMV感染致人原代星形胶质细胞分泌改变中的作用。 方法： 1.在人胚肺成纤维细胞中扩增HCMV病毒,并用空斑定量法测定病毒滴度。 2.原代培养人星形胶质细胞,免疫荧光法检测星形胶质细胞的标志蛋白—胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP),计算细胞纯度。 3. HCMV感染人星形胶质细胞,RT-PCR和免疫荧光法检测HCMV-IE,确定HCMV能否在人原代星形胶质中建立感染。 4. RT-PCR和Western blotting检测HCMV感染导致星形胶质细胞分泌的IL-6和IL-8表达变化。 5.免疫荧光法检测NF-κB的细胞核移位,Western blotting检测阻断NF-κB细胞核移位后,IL-6和IL-8的表达变化。 结果： 1. HCMV感染人胚肺成纤维细胞5d左右,超过80%细胞出现典型细胞病变效应(CPE),呈典型的巨细胞病毒感染后的细胞形态学改变。空斑测定结果显示将病毒液稀释10-5倍后,平均空斑数为5.5,计算后空斑形成单位为1.1×107pfu/ml。 2.分离、纯化的原代星形胶质细胞,经免疫荧光染色后在倒置显微镜下观察到细胞有较强的特异性绿色荧光,GFAP阳性率达到95%以上 3. RT-PCR和western blotting结果显示感染HCMV的星形胶质细胞均可检测到HCMV-IE的表达,而未感染的细胞则检测不到。 4. RT-PCR检测HCMV感染人原代星形胶质细胞0、6、12、24、48和96h时mRNA比值IL-6/β-actin分别为0.23±0.05、1.31±0.07、1.18±0.05、1.13±0.04、0.74±0.02和0.67±0.04,IL-8/β-actin分别为0、0.65±0.04、0.54±0.06、0.42±0.04、0.19±0.03和0.36±0.05。感染组IL-6和IL-8mRNA的表达较未感染细胞差别具有统计学意义(p0.05)。Western blotting检测感染0、36、48、72、96和120h时蛋白比值IL-6/β-actin分别为0.043±0.01、0.931±0.02、0.852±0.05、0.983±0.03、1.32±0.02不和0.95±0.02,IL-8/β-actin分别为0、0.42±0.01、0.61±0.02、1.12±0.03、1.55±0.02和10.81±0.04。感染组IL-6和IL-8蛋白的表达较未感染细胞差别具有统计学意义(P0.05)。 5.免疫荧光结果显示HCMV (?)感染原代星形胶技细胞2、4、7h时,NF-κB发生了细胞核移位,其中7h的细胞核移位最为明显；而用10μM PDTC(NF-κB活化的抑制剂)孵育的细胞用HCMV感染时未见明显的NF-κB细胞核移位。Western blotting检测未染毒、PDTC孵育、HCMV感染及HCMV与PDTC共同作用的细胞蛋白比值IL-6/β-actin分别为0.023±0.01、0.017±0.03、1.642±0.01和0.102±0.01,IL-8/β-actin分别为0、0、1.12±0.01和0HCMV感染细胞IL-6和IL-8蛋白的表达较其它三组细胞差别具有统计学意义(P0.05)。 结论： 1.HCMV能够在人原代星形胶质细胞中建立感染。 2.HCMV感染诱导人原代星形胶质细胞分泌IL-6和IL-8。, 3.HCMV感染致星形质细胞分泌的IL-6和IL-8表达异常是通过活化NF-κB实现的。
【关键词】：人巨细胞病毒 人原代星形胶质细胞 白细胞介素6 白细胞介素8 NF-κB信号通路
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373
【目录】：

• 摘要2-4
• Abstract4-8
• 引言8-10
• 第一章 实验材料10-16
• 1.1 细胞10
• 1.2 病毒10
• 1.3 实验仪器和设备10-11
• 1.4 主要实验试剂及配制11-16
• 第二章 实验方法16-28
• 2.1 细胞的获取及保存16-18
• 2.2 HCMV AD169株毒种的增殖和滴度测定18-19
• 2.3 HCMV感染人原代星形胶质细胞模型的建立19-20
• 2.4 HCMV感染对人原代星形胶质细胞IL-6和IL-8表达的影响20-26
• 2.5 免疫荧光法检测NF-κB的核移位及其与IL-6和IL-8表达异常的关系26
• 2.6 统计学分析26-28
• 第三章 实验结果28-36
• 3.1 原代细胞的培养28-29
• 3.2 原代星形胶质细胞的鉴定29
• 3.3 HCMV AD169毒株的增殖和定量29-30
• 3.4 HCMV感染人原代星形胶质细胞模型的建立30-32
• 3.5 HCMV感染人原代星形胶质细胞后IL-6和IL-8的表达变化32-33
• 3.6 免疫荧光法检测NF-κB的转位及其与IL-6和IL-8表达异常的关系33-36
• 第四章 讨论36-40
• 4.1 HCMV的基因组成及其调控宿主基因表达的关键基因36
• 4.2 NF-κB信号通路及其调控的炎性因子36-37
• 4.3 HCMV感染星形胶质细胞及其致神经系统损伤致病机制的讨论37-40
• 第五章 结论40-42
• 参考文献42-44
• 文献综述44-58
• 参考文献52-58
• 攻读学位期间的研究成果58-60
• 致谢60-62

【参考文献】

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1 侯云;李玲;胡明;姜光域;王倩;钱冬萌;闫志勇;赵巍;宋旭霞;王斌;;HSV-1感染对神经胶质瘤细胞神经生长因子及其受体表达的影响[J];病毒学报;2010年06期

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3 徐进平,叶林柏;HCMV IE86蛋白与转录激活因子的相互作用[J];中国科学(C辑:生命科学);2002年03期

4 侯云;王斌;李玲;胡明;辛晓妮;钱冬萌;闫志勇;赵巍;宋旭霞;;HSV-1感染对神经胶质瘤细胞NGF和BDNF表达变化的研究[J];实用医学杂志;2011年07期

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本文编号：812264