激活的Rap1和H-Ras对E-Cadherin介导的细胞间粘附连接的调节

发布时间：2017-09-10 16:47

  本文关键词：激活的Rap1和H-Ras对E-Cadherin介导的细胞间粘附连接的调节

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【摘要】：粘附连接是E-cadherin（E-钙粘蛋白）介导的上皮细胞间粘附结构，其胞外部分是反式相互作用的E-钙粘蛋白，胞内通过p120-连环蛋白(p120-catenin)、β-连环蛋白(β-catenin)结合到肌动蛋白细胞骨架上。粘附连接不仅将相邻细胞依次连接起来，维持上皮细胞正常的形态和极性，而且参与细胞间及胞内的信号转导，具有抑制肿瘤发生和转移的功能。Ras家族小分子量G蛋白对E-钙粘蛋白有重要的调节作用，Rap1调控E-钙粘蛋白介导的粘附连接的形成和定位，，但此过程中Rap1作用的下游信号通路仍是未知的。有文献报道抑制H-Ras的活性能增强E-钙粘蛋白的表达，小鼠胚胎成纤维细胞缺乏H-Ras时表现出较低的增殖和迁移能力，但H-Ras对E-钙粘蛋白是否具有调节作用尚未定论。为阐明Rap1和H-Ras能否协同或拮抗地调节E-钙粘蛋白介导的粘附连接的形成，我们使用Ca~(2+)开关模拟粘附连接解体和重建模型，利用GST-Pull down技术研究了Rap1和H-Ras活性在粘附连接重建过程中的变化规律，发现MCF-7细胞中Rap1和H-Ras在Ca~(2+)饥饿引起的粘附连接解离时均被激活。此外，通过Co-IP技术研究了Rap1和H-Ras在粘附连接重建过程中相互作用蛋白的变化情况，通过FRET技术研究了Rap1和H-Ras在细胞内被激活的位置，研究发现，Rap1和H-Ras的激活均与Ca~(2+)开关实验介导的粘附连接重建有关。Rap1调节E-钙粘蛋白的候补下游因子主要是一些细胞骨架蛋白、细胞骨架调节蛋白以及小分子量G蛋白的GAPs，H-Ras调节E-钙粘蛋白的下游因子可能也包括一些细胞骨架蛋白。Rap1起始活化时核周围的活化水平高于细胞膜处，细胞膜和胞质中的H-Ras活性化水平均在粘附连接解体时上升，粘附连接重建时下调。 通过本课题的研究，我们能够进一步了解Rap1和H-Ras之间的联系以及调控E-钙粘蛋白介导的细胞间粘附连接的分子机理。
【关键词】：Rap1 H-Ras E-钙粘蛋白 粘附连接 Ca~(2+)开关实验
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-8
• 第1章 绪论8-22
• 1.1 课题背景及研究的目的和意义8
• 1.2 粘附连接简介8-12
• 1.2.1 粘附连接的结构8-10
• 1.2.2 细胞间粘附连接构建和解离的动态平衡10-11
• 1.2.3 粘附连接的肿瘤生物学意义11-12
• 1.3 Ras 家族 G 蛋白简介12-15
• 1.3.1 关于 Rap1 的研究12-13
• 1.3.2 关于 H-Ras 的研究13-15
• 1.3.3 Rap1 与 H-Ras 的关系15
• 1.4 Rap1 与 H-Ras 各自的相互作用蛋白15-17
• 1.5 调控 E-钙粘蛋白介导的细胞间粘附连接的分子机制17-20
• 1.6 本文的主要研究内容20-21
• 1.7 技术路线21-22
• 第2章 实验材料与方法22-35
• 2.1 实验材料22-25
• 2.1.1 重组体质粒22
• 2.1.2 构建 FRET 重组体所需引物22
• 2.1.3 菌株和细胞系22-23
• 2.1.4 主要试剂材料及试剂配方23-24
• 2.1.5 主要仪器24-25
• 2.1.6 主要分析软件25
• 2.2 实验方法25-34
• 2.2.1 重组体的扩增与构建25-29
• 2.2.2 MCF-7 细胞的培养及转染29-31
• 2.2.3 Ca~(2+)开关实验31
• 2.2.4 GST-Pull down31-32
• 2.2.5 Co-Immunoprecipitation32
• 2.2.6 Western blot 检测蛋白水平32-33
• 2.2.7 Neuhoff 胶体染色33-34
• 2.2.8 激光共聚焦显微镜观察 FRET34
• 2.3 本章小结34-35
• 第3章 Rap1 和 H-Ras 的活性在粘附连接重建过程中的变化规律35-40
• 3.1 GST 融合蛋白的诱导表达35-36
• 3.2 建立 MCF-7 细胞的粘附连接重建模型36
• 3.3 GST-Pull down 和 Western Blot 确定 Rap1 和 H-Ras 的水平36-38
• 3.3.1 粘附连接解体和重建激活 Rap136-37
• 3.3.2 粘附连接解体激活重建抑制 H-Ras37-38
• 3.4 讨论38-39
• 3.5 本章小结39-40
• 第4章 Rap1 和 H-Ras 相互作用蛋白在粘附连接重建中的变化及联系40-47
• 4.1 转染 EGFP-C3、EGFP-C3-Rap1、EGFP-C3-H-Ras 的细胞系40-41
• 4.2 Co-IP 研究 Rap1 和 H-Ras 相互作用蛋白在粘附连接重建中的变化41-43
• 4.3 质谱分析43
• 4.4 讨论43-45
• 4.5 本章小结45-47
• 第5章 激活的 Rap1 和 H-Ras 在细胞内的定位47-55
• 5.1 已构建 FRET 重组体的验证48-49
• 5.2 转染 FRET 重组体的 MCF-7 细胞系49
• 5.3 激光共聚焦显微镜下定位细胞内激活的 Rap1 和 H-Ras49-53
• 5.3.1 粘附连接重建过程中 Rap1 激活位置的变化50-51
• 5.3.2 粘附连接重建过程中 H-Ras 激活位置的变化51-53
• 5.4 讨论53-54
• 5.5 本章小结54-55
• 结论55
• 展望55-56
• 参考文献56-63
• 附录63-66
• 致谢66

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