诺如病毒多表位抗原基因的表达及多克隆抗体制备

发布时间：2017-09-10 18:36

  本文关键词：诺如病毒多表位抗原基因的表达及多克隆抗体制备

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【摘要】：诺如病毒是引起人类非细菌性胃肠炎的主要病原之一，可导致严重的公共卫生问题。诺如病毒具有很高的传染性和变异性，可以使各年龄段的人引发急性胃肠炎，尤其在抵抗力弱的人群中有很高的发病率，因此快速、尽早地确诊对预防和控制诺如病毒的传播是非常重要的。近年来对诺如病毒的研究，多是采用表达全长ORF2所编码的衣壳蛋白，制备单克隆抗体，再通过ELISA等方法进行检测，其对单一基因型诺如病毒的检测无疑是准确的，却无法同时确定多个基因型别的样品，这限制了其在检测中的应用。多表位抗原基因是运用重组DNA技术将多个编码抗原表位的核苷酸片段串连组合起来构成，其在HIV、CSFV和结核杆菌等方面的研究已经取得突破性进展，然而目前对诺如病毒多表位抗原基因的研究还未见报道。本论文通过化学合成、PCR扩增和酶切连接相结合的方法将4段S区表位序列进行串联，，在原核表达系统中诱导表达得到重组融合蛋白；用纯化得到的重组融合蛋白免疫兔子，获得兔抗NoV多克隆抗体；利用制备的兔抗NoV多克隆抗体包被磁珠，获得免疫磁珠，应用免疫磁珠对诺如病毒颗粒进行富集研究，得到以下结果： (1)根据已经发表文献中表位信息，选择诺如病毒衣壳蛋白靠近N端S区的3个表位，通过化学合成的方法得到NoV多表位抗原基因前段基因片段A；结合本实验室前期的研究内容和NCBI中提供的序列信息，根据S区设计引物，以编号1004株诺如病毒cDNA为模板，扩增得到NoV多表位抗原基因后段基因片段B；将A和B连接起来构建了诺如病毒多表位抗原基因，核苷酸长438bp，共编码145个氨基酸，并将其与表达质粒pET-32a(+)连接，转化到BL21（DE3）中进行原核表达，得到34kDa的重组融合蛋白。30°C诱导6h后，经SDS-PAGE分析，目的蛋白占全菌总蛋白的35%左右，并且大部分为可溶性蛋白，利用亲和层析方法纯化得到重组融合蛋白。 (2)将纯化得到的重组融合蛋白浓缩后加入免疫佐剂免疫兔子，经5次免疫后，心脏采血获得抗血清，用辛酸-硫酸铵盐析法纯化多克隆抗体，间接ELISA法测定抗体效价为1:51200。 (3)将兔抗NoV多克隆抗体包被磁珠，对磁珠与抗体偶联条件进行优化，优化后的条件为：最佳包被介质为PBS，最佳pH为7.4，最佳包被时间为3h，最佳包被温度为20°C，最佳抗体浓度为300μg/mL。用制备的免疫磁珠对肛拭子中诺如病毒进行富集研究，提取富集前后的病毒RNA，并用实时荧光定量PCR方法检测，结果表明富集后的诺如病毒检测结果均为阳性，免疫磁珠对GI、GII型诺如病毒都有吸附效果，制备的多克隆抗体能很好的与诺如病毒颗粒产生特异性结合。
【关键词】：诺如病毒 多表位基因 克隆表达 抗体制备 免疫磁珠
【学位授予单位】：集美大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373;R392
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 主要符号表10-11
• 第1章 引言11-22
• 1.1 诺如病毒基本特征11-13
• 1.1.1 诺如病毒的传播及流行11-12
• 1.1.2 诺如病毒形态学及分子生物学特征12-13
• 1.1.3 诺如病毒的分型13
• 1.2 诺如病毒检测方法研究进展13-17
• 1.2.1 RT-PCR 方法14-15
• 1.2.2 免疫学方法15-16
• 1.2.3 基因芯片技术16-17
• 1.2.4 展望17
• 1.3 诺如病毒衣壳蛋白的表达17-18
• 1.3.1 NoV 衣壳蛋白杆状病毒表达系统17-18
• 1.3.2 NoV 衣壳蛋白原核表达系统18
• 1.4 多表位抗原基因的研究进展18-21
• 1.4.1 抗原表位的预测18-19
• 1.4.2 多表位抗原基因的设计19
• 1.4.3 多表位抗原基因的应用19-21
• 1.5 本论文的研究目的与意义21
• 1.6 研究内容21-22
• 1.6.1 诺如病毒多表位基因的构建及表达21
• 1.6.2 兔抗 NoV 多克隆抗体的制备21
• 1.6.3 免疫磁珠的初步应用21-22
• 第2章 诺如病毒多表位抗原基因的构建、表达及蛋白纯化22-45
• 2.1 实验材料22-25
• 2.1.1 实验动物及病毒株22
• 2.1.2 主要试剂22-23
• 2.1.3 主要仪器设备23-24
• 2.1.4 主要溶液的配制24-25
• 2.2 实验方法25-35
• 2.2.1 NoV 多表位抗原基因前段基因片段 A 的设计与合成25
• 2.2.2 NoV 多表位抗原基因后段基因片段 B 的克隆25-28
• 2.2.3 重组质粒 pET-novme 的构建28-31
• 2.2.4 重组质粒的诱导表达及蛋白纯化31-33
• 2.2.5 表达产物的 Western Blot 分析33
• 2.2.6 Bradford 法测定蛋白浓度33-34
• 2.2.7 多克隆抗体的制备34
• 2.2.8 兔抗多克隆抗体的纯化34-35
• 2.2.9 ELISA 方法测定抗体效价35
• 2.3 实验结果35-42
• 2.3.1 NoV 多表位抗原基因前段基因片段 A 的合成35-36
• 2.3.2 NoV 多表位抗原基因后段基因片段 B 的扩增36-37
• 2.3.3 重组质粒 pET-novme 的构建及鉴定37-38
• 2.3.4 多表位基因的生物信息学特征38-40
• 2.3.5 复合基因的表达、纯化及鉴定40
• 2.3.6 蛋白浓度的测定40-41
• 2.3.7 抗体纯化效果分析41
• 2.3.8 抗体效价的测定41-42
• 2.4 分析与讨论42-45
• 第3章 免疫磁珠法富集诺如病毒初步研究45-55
• 3.1 实验材料45-46
• 3.1.1 实验所用病毒株45
• 3.1.2 主要试剂45-46
• 3.1.3 主要仪器设备46
• 3.1.4 主要溶液的配制46
• 3.2 实验方法46-49
• 3.2.1 兔抗 NoV 多克隆抗体与磁珠偶联条件的确定46-47
• 3.2.2 免疫磁珠的封闭与保存47-48
• 3.2.3 免疫磁珠对 NoV 的富集研究48-49
• 3.2.4 免疫磁珠技术的特异性实验49
• 3.3 实验结果49-54
• 3.3.1 兔抗 NoV 多克隆抗体与磁珠的最佳偶联条件49-51
• 3.3.2 免疫磁珠捕获 NoV 效果分析51-53
• 3.3.3 免疫磁珠的特异性53-54
• 3.4 分析与讨论54-55
• 第4章 结论与创新点55-57
• 4.1 本论文的研究总结55
• 4.2 展望55-56
• 4.3 创新点56-57
• 致谢57-58
• 参考文献58-63
• 在学期间发表的学术论文63

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

1 方肇寅;谢华萍;吕红霞;刘娜;章青;段招军;Duncan Steele;Baoming Jiang;Xi Jiang;;1999~2005年我国婴幼儿人杯状病毒腹泻研究[J];病毒学报;2007年01期

2 罗剑鸣;吴希阳;徐子乾;罗乐;聂凯;杨梦婕;曾亚岚;段招军;马学军;;基于颜色判定的逆转录环介导等温扩增技术检测GII型诺如病毒基因[J];病毒学报;2012年02期

3 史蕾;顾大勇;徐云庆;吕志平;黄彤文;赵纯中;臧庆伟;张亮;冬冰;;基于磁珠的可视化基因芯片在诺如病毒快速检测中的应用[J];中国热带医学;2009年04期

4 朱锡华,吴玉章;对表位生物学研究的认识和体会[J];上海免疫学杂志;1998年01期

5 莫雪梅;高东微;;SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR法检测贝类中的诺如病毒[J];生物工程学报;2010年06期

6 李雅静;吴绍强;;免疫磁性分离技术在食源性疾病检测中的应用[J];食品工业科技;2008年12期

7 南海;沈权;华修国;崔立;;诺如病毒研究进展[J];上海畜牧兽医通讯;2010年05期

本文编号：825984