miR-29a靶向调节骨髓间充质干细胞HMGN3基因表达研究

发布时间：2017-09-12 08:17

  本文关键词：miR-29a靶向调节骨髓间充质干细胞HMGN3基因表达研究

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【摘要】：MiRNA是一种大小约21-23个碱基的单链小分子RNA,定位于RNA前体的3’端或者5’端,参与调控基因表达,从而广泛地参与细胞生物学过程,包括发育、细胞增殖、分化、凋亡等。 间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)体外增殖和分化均受miRNAs调控。MSCs是来源于中胚层的成体干细胞,广泛存在于全身结缔组织和器官间质中,以骨髓组织中含量最为丰富。MSCs具有高度增殖、自我更新和多向分化潜能。本实验室前期实验结果表明miR-29a/b参与体外MSCs向神经细胞的分化调控,同时通过生物信息学分析,预测与细胞周期调控以及转录因子相关的MYCN、HMGN3、MAFB和PTP4A1是miR-29的靶基因。 本文通过在MSCs中高表达miR-29a,检测PTP4A1、HMGN3、MAFB和MYCN的表达改变,进一步利用双荧光素酶报告系统验证miR-29a与靶基因的直接靶向作用,并进一步证明miR-29a可通过靶向上述基因从而参与MSCs向神经细胞的分化调控。目的 研究miR-29a对骨髓MSCs的神经分化和增殖调控的靶基因。 方法 1.大鼠骨髓MSCs的体外分离和培养。分离SD大鼠双侧股骨和胫骨骨髓,培养大鼠的MSCs至第三代。 2.慢病毒介导miR-29a前体在MSCs中表达。 3.实时定量PCR (qRT-PCR)检测MYCN、HMGN3、PTP4A1和MYAB基因表达的mRNA表达。 4.免疫印迹法(western blot, WB)检测HMGN3的蛋白表达。 5.双荧光素酶报告系统验证miR-29a靶向HMGN3。 6.统计学分析。采用SPSS12.0统计软件进行分析。独立实验重复3次,数值用样本均数±标准差(X±S)表示,采用独立样本t检验比较两组间差异,以Q=0.05为检验标准。结果 1.体外分离、培养和扩增骨髓MSCs 体外分离培养大鼠骨髓MSCs,采用反复贴壁纯化方法,当传至第三代时,细胞纯化超过99%,满足实验要求。 2.慢病毒介导miR-29a在MSCs中高表达 用制备好的病毒上清感染P3MSCs,4d后EGFP荧光到达高峰,MSCs细胞维持梭形、克隆样增生。miR-29a表达量在miR-29a感染组中显著增高(4倍)。 3. miR-29a高表达抑制IYCN和HMGN3在MSCs中的表达 检测miR-29a预测靶基因MYCN、HMGN3、PTP4A1和MYAB的mRNA表达,结果显示在四种基因中,MYCN和HMGN3的表达在miR-29a高表达的MSCs中显著降低。免疫印迹法显示HMGN3蛋白表达同时降低。 4. miR-29a直接靶向HMGN3 利用pmirGLO载体多克隆位点,成功将HMGN33' UTR基因结合区克隆到Nhe1和Sal1酶切位点。 利用脂质体转染法将HMGN3-pmirGLO质粒转染进入PC12细胞,48h后再用慢病毒介导miR-29a前体在PC12细胞中高表达,感染48h后80%以上PC12细胞被成功感染并显示EGFP绿色荧光,qRT-PCR检测miR-29a表达增高约5倍。 双荧光素酶报告基因检测结果显示miR-29a可显著降低荧光素酶显色,证明miR-29a可直接靶向HMGN33'UTR区并抑制其表达。结论 miR-29a靶向并抑制HMGN3在骨髓间充质干细胞中的表达,提示其可能参与MSCs向神经细胞的分化调控。
【关键词】：间充质干细胞 神经分化 microRNA HGN3 MYCN
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-10
• 目录10-11
• 英文缩略词表11-12
• 前言12-14
• 材料和方法14-22
• 结果22-27
• 讨论27-29
• 结论29-30
• 参考文献30-33
• 综述 miRNA在神经发育和神经性疾病中的作用33-47
• 参考文献43-47
• 个人简介47
• 在学期间发表学术论文47-48
• 致谢48

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1 程琦;miR-29a靶向调节骨髓间充质干细胞HMGN3基因表达研究[D];郑州大学;2013年

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本文编号：836082