基于NASBA技术检测细菌耐药性方法的建立

发布时间：2017-09-12 11:42

  本文关键词：基于NASBA技术检测细菌耐药性方法的建立

  更多相关文章： NASBA 耐药 KPC基因

【摘要】：目的：产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌在世界各地的爆发威胁着人类的生命健康，而且携带KPC的细菌感染与高死亡率呈正相关。因此及时准确快速的检出产KPC细菌对预防、控制耐药菌株的流行意义重大。推荐的改良Hodge试验准确性高，但较费时。PCR扩增检测时间大大缩短，但对仪器设备和场所要求较高。核酸序列依赖性扩增NASBA具有操作简便、扩增效率高、特异性强的优点。本研究旨在建立检测KPC耐药的NASBA检测方法，并对该方法进行初步评价。 方法：本实验采用依赖KPC转录产物mRNA的NASBA扩增检测KPC耐药。根据Genebank中肺炎克雷伯菌管家基因MDH的保守序列、肠杆菌科细菌耐药基因KPC的保守序列设计NASBA引物，将上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定。同时摸索及优化NASBA反应中各酶浓度、离子浓度、反应温度等条件，分析该方法的灵敏度和特异性。采用该NASBA方法、PCR及逆转录PCR检测临床收集的45株肺炎克雷伯菌，比较结果的一致性。 结果：KPC及MDH的NASBA扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分别得到249nt、190nt的特异性条带，并且测序鉴定序列与预计片段序列比对一致。通过摸索及优化NASBA反应中各酶浓度、离子浓度、反应温度等条件建立NASBA扩增体系（24μl）：缓冲液中氯化钾终浓度60mmol/L，，氯化镁终浓度14mmol/L，PH8.0Tris-HCl终浓度40mmol/L，DTT终浓度7.5mmol/L，DMSO终浓度15%；每个引物终浓度0.2μmol/L；dNTP1mmol/L；NTP2mmol/L；酶混合液中T7RNA聚合酶50U、AMV逆转录酶10U、RNase H0.5U、BSA0.1mg/ml；反应温度：40℃；反应时间：90min。该NASBA方法能检测到10-3ng/μl的RNA量，较RT-PCR方法多2个数量级，提示该方法比RT-PCR灵敏度高；对照KPC阴性菌株与KPC阳性菌株的NASBA扩增产物电泳分析发现仅KPC阳性菌株出现特异性条带。45株临床收集的肺炎克雷伯菌中32株NASBA扩增阳性，13株NASBA扩增阴性，与药敏、PCR、RT-PCR结果一致，符合率达到100%。 结论：NASBA方法检测KPC型碳青霉烯酶耐药简便快速，并且灵敏度和特异性均较高，具有广阔的应用前景。
【关键词】：NASBA 耐药 KPC基因
【学位授予单位】：宁波大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378.996
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 引言12-14
• 第一部分 肺炎克雷伯菌 MDH NASBA 扩增方法的建立14-32
• 1 材料14-15
• 1.1 菌株14
• 1.2 主要仪器及耗材14
• 1.3 主要试剂及配制方法14-15
• 1.3.1 主要试剂14-15
• 1.3.2 培养基配制15
• 1.3.3 NASBA 扩增试剂配制15
• 2 方法15-19
• 2.1 NASBA 扩增15-17
• 2.1.1 引物设计15-16
• 2.1.2 提取细菌 RNA16
• 2.1.3 NASBA 扩增16-17
• 2.2 NASBA 扩增产物的鉴定17
• 2.2.1 琼脂糖凝胶电泳鉴定 NASBA 扩增产物17
• 2.2.2 NASBA 扩增产物核苷酸测序、分析17
• 2.3 NASBA 扩增条件的优化17-19
• 2.3.1 NASBA 扩增反应温度的优化18
• 2.3.2 NASBA 扩增时间的选择18
• 2.3.3 NASBA 扩增酶浓度的优化18
• 2.3.3.1 NASBA 扩增 T7 RNA 聚合酶最佳反应浓度的选择18
• 2.3.3.2 NASBA 扩增 RNA 酶 H 最佳反应浓度的选择18
• 2.3.3.3 NASBA 扩增 AMV 逆转录酶最佳反应浓度的选择18
• 2.3.4 NASBA 扩增试剂浓度的优化18-19
• 2.3.4.1 NASBA 扩增氯化钾浓度的优化18
• 2.3.4.2 NASBA 扩增氯化镁浓度的优化18-19
• 2.3.4.3 NASBA 扩增 DTT 浓度的优化19
• 3 结果19-29
• 3.1 琼脂糖凝胶电泳鉴定 NASBA 扩增产物19-20
• 3.2 NASBA 扩增产物测序、分析20-21
• 3.3 NASBA 扩增反应条件的优化21-29
• 3.3.1 NASBA 扩增反应温度的筛选21-22
• 3.3.2 NASBA 扩增时间的选择22-23
• 3.3.3 NASBA 扩增酶浓度的优化23-26
• 3.3.4 NASBA 扩增试剂浓度的优化26-29
• 4 小结与讨论29-32
• 4.1 初步建立 NASBA 扩增方法29
• 4.2 NASBA 检测方法的建立29-30
• 4.3 NASBA 反应条件对扩增效率的影响30
• 4.4 NASBA 的优势30-32
• 4.4.1 高特异性30-31
• 4.4.2 高灵敏度31
• 4.4.3 高保真度31
• 4.4.4 应用前景广31-32
• 第二部分 肺炎克雷伯菌 KPC 的PCR 检测及RT-PCR 检测32-48
• 1 材料32-33
• 1.1 菌株32
• 1.2 主要仪器及耗材32
• 1.3 主要试剂32-33
• 2 方法33-36
• 2.1 药敏分析判断标准33
• 2.2 PCR 引物设计33
• 2.3 培养基的制备33-34
• 2.4 DNA 提取34
• 2.5 PCR 检测34-35
• 2.5.1 PCR 反应体系34-35
• 2.5.2 PCR 反应参数35
• 2.5.3 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳检测35
• 2.6 RNA 提取35
• 2.7 RT-PCR 检测35-36
• 2.7.1 RT-PCR 反应体系35-36
• 2.7.2 RT-PCR 反应条件36
• 2.7.3 RT-PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳检测36
• 2.8 特异性检测36
• 2.9 灵敏度检测36
• 3 结果36-47
• 3.1 药敏分析结果36
• 3.2 KPC PCR 扩增结果36-38
• 3.3 KPC RT-PCR 特异性检测38-39
• 3.4 KPC RT-PCR 灵敏度检测39-40
• 3.5 KPC RT-PCR 扩增结果40-47
• 3.5.1 RNA 提取结果40-42
• 3.5.2 RNA 16s rDNA PCR 结果42-44
• 3.5.3 cDNA KPC PCR 结果44-47
• 4 小结与讨论47-48
• 第三部分 肺炎克雷伯菌 KPC NASBA 检测方法的评价与初步应用48-64
• 1 材料48-50
• 1.1 菌株48
• 1.2 主要仪器及耗材48
• 1.3 主要试剂48-49
• 1.4 NASBA 扩增引物设计49-50
• 2 方法50-51
• 2.1 NASBA 扩增产物核苷酸测序、分析50
• 2.2 MDH 基因灵敏度及特异性实验50-51
• 2.2.1 MDH 基因灵敏度实验50
• 2.2.2 MDH 基因特异性实验50-51
• 2.3 KPC 基因灵敏度及特异性实验51
• 2.3.1 KPC 基因灵敏度实验51
• 2.3.2 KPC 基因特异性实验51
• 2.4 NASBA 方法的临床初步应用51
• 2.5 统计学分析51
• 3 结果51-62
• 3.1 NASBA 扩增产物核苷酸测序、分析51-52
• 3.2 MDH 基因灵敏度及特异性实验52-54
• 3.2.1 MDH 基因灵敏度实验52-53
• 3.2.2 MDH 基因特异性实验53-54
• 3.3 KPC 基因灵敏度及特异性实验54-56
• 3.3.1 KPC 基因灵敏度实验54-55
• 3.3.2 KPC 基因特异性实验55-56
• 3.4 NASBA 方法的临床初步应用56-62
• 3.4.1 NASBA 扩增结果56-62
• 4 小结与讨论62-64
• 结论64-65
• 参考文献65-68
• 附录A NASBA 技术在致病菌检测中的应用68-75
• 参考文献73-75
• 在学研究成果75-76
• 致谢76

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