空肠弯曲菌感染仔兔模型的建立及动物体内诱导基因的筛选

发布时间：2017-09-12 19:07

  本文关键词：空肠弯曲菌感染仔兔模型的建立及动物体内诱导基因的筛选

  更多相关文章： 空肠弯曲菌 仔兔模型 组织分布 免疫应答 SCOTS 致病性

【摘要】：空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni, Cj)是一种重要的食源性人兽共患病原菌。人感染Cj后主要引起细菌性胃肠炎(Bacterial gastroenteritis)和急性腹泻,免疫力低下者会导致心内膜炎、关节炎、骨髓炎、脑炎、败血症等全身性疾病。但迄今为止,对Cj致病性方面的研究尚不很清楚,其主要原因是缺乏合适的动物模型。本研究尝试建立空肠弯曲菌感染仔兔腹泻模型,探索该菌在仔兔模型体内的动态分布、免疫应答规律及可能的感染机制；并利用选择性捕获转录序列方法鉴定了空肠弯曲菌在感染兔体内转录的基因,取得了满意结果。 一、空肠弯曲菌致仔兔腹泻模型的建立 本研究选用初生仔兔为实验动物,因为相比啮齿类动物,兔在系统发育和生理构造上更相似于人类,初生动物还具有体内清洁、体型小、方便饲养和易于管理等优点。根据实验所得最佳建模条件,使用空肠弯曲菌NCTC11168为攻毒菌株,灌胃1×109CFU剂量感染经西咪替丁(50mg/kg)预处理的2日龄,体重为40+2g的仔兔。通过收集临床症状、病理变化、病原分离和致病性资料评价模型建立情况。结果显示空肠弯曲菌可人工感染仔兔并引起自限性的、水样腹泻症状；剖检发现主要病变是小肠积液、肠壁出现出血点,盲肠、结肠肿大,肠腔内充满水样内容物；组织病理切片显示盲肠黏膜出现坏死脱落,固有层小血管扩张、充血。病原分离鉴定结果证实各脏器感染菌株均为Cj。剂量反应实验显示腹泻疾病的程度与攻毒剂量、肠道细菌定植量正相关,至少106CFU细菌可引起仔兔可观察的腹泻症状和各肠道的定植；至少104CFU细菌可引起盲肠和结肠的定植。不同来源空肠弯曲菌分离株对仔兔致病性存在明显差异,说明该模型能够有效评价Cj的毒力强弱。 二、空肠弯曲菌仔兔体内感染动态分析 本研究在建立上述模型的基础上,分别在攻毒后12,24,36,48和60hr剖检仔兔,利用细菌分离及PCR方法分析Cj在体内各组织中的分布情况和变化规律；应用电子显微镜技术观察Cj侵入小肠上皮细胞后引起细胞形态变化规律；应用real-time RT-PCR技术检测Cj感染后仔兔小肠黏膜炎症趋化因子、细胞因子、抗菌物质和酶类的分泌量变化规律。研究结果显示Cj侵入血液的速度很快,对肝脏、肾脏等实质器官的黏附性无明显差异,并在48hr后被清除；Cj在盲肠和结肠中定植时间大于60hr,定植量高达108CFU/go扫描和透射电子显微镜结果显示Cj可黏附在肠绒毛,并在攻毒后24-36hr侵袭破坏部分上皮细胞；48-60hr可见部分上皮细胞脱落、凋亡,大量上皮内淋巴细胞浸润。Real-time RT-PCR结果显示感染后12hr可见IL-10和抗菌肽CAP-18的大量分泌,36hr时IL-18、CCL20分泌增加；60hr时IFN-y、IL-10、IL-8、iNOS发挥重要免疫作用。 三、选择性捕获空肠弯曲菌仔兔体内转录序列 本研究以空肠弯曲菌NCTC11168菌株为研究对象,采用选择性捕获转录序列(Selective capture of transcribed sequences, SCOTS)方法鉴定空肠弯曲菌NCTC11168在感染兔盲肠过程中细菌转录的基因序列。经过总RNA分离、cDNAs合成、PCR扩增、SCOTS、阳性克隆测序。结果共获得9个转录序列,按照其编码蛋白的功能分为4大类：新陈代谢蛋白、细胞表面蛋白、复制相关蛋白和应激相关蛋白。利用real-time RT-PCR对表达基因进行转录水平的验证,结果表明：pnp、katA、cj0609c、cj1481c和acs等5个基因与正常CCDA培养基中培养的11168菌株的基因转录水平相比,在感染兔盲肠组织中转录水平上调4.49-116倍,为进一步阐明筛选到的体内表达基因在Cj致病过程中的作用奠定了基础。
【关键词】：空肠弯曲菌 仔兔模型 组织分布 免疫应答 SCOTS 致病性
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R-332;R378.3
【目录】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-7
• 目录7-10
• 符号说明10-11
• 第一章 综述11-27
• 1 空肠弯曲菌病概述11-13
• 1.1 病原学11-12
• 1.2 流行病学12
• 1.3 临床症状12-13
• 1.4 临床治疗13
• 2 空肠弯曲菌感染动物模型研究进展13-17
• 2.1 灵长类动物13-14
• 2.2 雪貂(Mustela Pulourius Furo)14
• 2.3 仔猪(Piglet)14
• 2.4 兔(Rabbit)14-15
• 2.5 啮齿类动物15-16
• 2.6 鸡16-17
• 2.7 展望17
• 3 细菌体内毒力基因表达技术17-22
• 3.1 差异显示RT-PCR(DD-RT-PCR)18
• 3.2 差异荧光诱导(DFI)18
• 3.3 DNA芯片技术(DNA chip technique)18-19
• 3.4 代表性差异分析技术(RDA)19
• 3.5 体内表达技术(IVET)19-20
• 3.6 体内诱导抗原技术(IVIAT)20
• 3.7 信号标签诱变技术(STM)20
• 3.8 抑制消减杂交技术(SSH)20
• 3.9 选择性抗原捕获转录序列(SCOTS)20-22
• 3.10 展望22
• 参考文献22-27
• 第二章 空肠弯曲菌致仔兔腹泻模型的建立27-42
• 1 材料27-28
• 1.1 菌株及实验动物27
• 1.2 主要试剂27-28
• 1.3 主要仪器28
• 2 方法28-31
• 2.1 菌株复苏和传代培养28
• 2.2 攻毒方式28
• 2.3 评价指标28-29
• 2.4 实验动物Cj感染率分析29
• 2.5 攻毒剂量的确定29
• 2.6 实验仔兔体重的影响29
• 2.7 感染仔兔模型的建立29-30
• 2.7.1 临床观察和样品的采集29-30
• 2.7.2 感染动物菌株分离与鉴定30
• 2.8 组织病理切片分析30
• 2.9 剂量反应实验30-31
• 2.10 不同来源空肠弯曲菌分离株对仔兔模型致病性评价31
• 3 结果31-38
• 3.0 实验动物Cj感染率本底调查31
• 3.1 接种剂量31
• 3.2 仔兔体重31-32
• 3.3 临床症状32
• 3.4 病理变化32-33
• 3.5 各脏器细菌的分离鉴定33-36
• 3.6 剂量反应实验36-37
• 3.7 不同来源空肠弯曲菌分离株对仔兔模型致病性评价37-38
• 4 讨论38-40
• 参考文献40-42
• 第三章 空肠弯曲菌仔兔体内感染动态分析42-54
• 1 材料42-43
• 1.1 菌株及实验动物42
• 1.2 主要试剂42-43
• 1.3 主要仪器43
• 2 方法43-46
• 2.1 动物接种43
• 2.2 样品采集和处理办法43
• 2.3 细菌组织分布动态检测43-44
• 2.3.1 细菌在实质性器官和血液中消长规律43
• 2.3.2 细菌在肠道中消长规律43-44
• 2.4 电子显微镜检测44
• 2.4.1 扫描电子显微镜的观察44
• 2.4.2 透射电子显微镜观察44
• 2.5 感染后肠组织细胞因子分泌动态变化分析44-46
• 2.5.1 样品RNA提取44-46
• 2.5.2 荧光定量PCR46
• 3 结果46-50
• 3.1 感染组织中空肠弯曲菌的动态分布46-48
• 3.2 空肠弯曲菌感染肠道扫描电镜、透射电镜观察48-50
• 3.3 空肠弯曲菌感染宿主天然免疫应答50
• 4 讨论50-52
• 参考文献52-54
• 第四章 选择性捕获空肠弯曲菌仔兔体内转录序列54-69
• 1 材料54-56
• 1.0 菌株和质粒54
• 1.1 实验动物和动物试验54-55
• 1.2 主要试剂55
• 1.3 主要仪器55
• 1.4 引物55-56
• 2 方法56-62
• 2.1 空肠弯曲菌基因组DNA的提取56
• 2.2 空肠弯曲菌rDNA的克隆与鉴定56-58
• 2.3 RNA的分离、cDNA的合成、PCR扩增58-60
• 2.3.1 RNA的提取与纯化58-59
• 2.3.2 cDNA第一链的合成59
• 2.3.3 cDNA第二链的合成59
• 2.3.4 PCR反应59-60
• 2.4 选择性捕获转录序列60-61
• 2.4.1 基因组DNA的生物素标记和超声波处理60
• 2.4.2 样品杂交60-61
• 2.4.3 转录序列的捕获61
• 2.5 SCOTS克隆的PCR鉴定和测序61-62
• 2.6 Real-time RT-PCR验证差异表达基因62
• 3 结果62-65
• 3.1 细菌基因组DNA的定量62
• 3.2 空肠弯曲菌rDNA的克隆与重组质粒的鉴定62
• 3.3 生物素标记的11168菌株基因组及rDNA重组质粒的破碎62-63
• 3.4 RNA的测定63-64
• 3.5 SCOTS结果64
• 3.6 感染相关基因的功能注释64
• 3.7 筛选基因的Real-time RT-PCR验证64-65
• 4 讨论65-67
• 参考文献67-69
• 附录69-71
• 攻读硕士学位期间发表论文目录71-72
• 致谢72-73

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

1 张建中;;空肠弯曲菌病[J];传染病信息;2005年02期

2 何书海;陈宏智;焦凤超;;动物病理组织切片制作方法的改良[J];动物医学进展;2011年11期

3 刘怀军,陈薇,刘瑞春,李春岩,李林芳,王勇;空肠弯曲菌感染后中枢神经系统病变动物模型的初步研究[J];脑与神经疾病杂志;2005年01期

4 徐飞;邢丛丛;陈扬;李震中;白欣立;;吉兰-巴雷综合征空肠弯曲菌感染诱导巴马小型猪致周围神经病动物模型的建立[J];脑与神经疾病杂志;2012年02期

5 杨军,宋纪真,尹启生,侯明生;代表性差别分析方法及其改进[J];生物技术通讯;2005年05期

6 黄金林;尹衍新;梅德霞;张弓;潘志明;刘秀梵;焦新安;;空肠弯曲菌FlaA单克隆抗体的制备与鉴定[J];微生物学报;2010年08期

7 姚潇,黄留玉,杨伯伦,苏国富;一种体内研究病原体致病机理的新方法——信号标签诱变技术[J];遗传;2002年06期

8 商宇伟;王楠;黄金林;焦新安;;空肠弯曲菌感染动物模型的研究进展[J];中国实验动物学报;2013年04期

中国博士学位论文全文数据库 前3条

1 周祖涛;鸭疫里氏杆菌免疫诊断方法及在感染鸭肝脏差异表达基因的研究[D];华中农业大学;2009年

2 金卉;副猪嗜血杆菌感染和应激相关基因的鉴定与功能研究[D];华中农业大学;2009年

3 李求春;利用IVIAT技术筛选鸡白痢沙门菌体内感染相关因子及pSPI12质粒的鉴定与IpaJ蛋白的功能分析[D];扬州大学;2010年

，

本文编号：838983