miR-24抑制低温诱导的心肌细胞凋亡及其机制

发布时间：2017-09-13 00:35

  本文关键词：miR-24抑制低温诱导的心肌细胞凋亡及其机制

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【摘要】：目的： 研究25°C低温环境能否诱导心肌细胞凋亡，探讨miR-24能否抑制低温诱导的心肌细胞凋亡及其可能的机制。 方法： 以H9C2心肌样细胞为研究对象，（1）将H9C2心肌细胞置于25°C低温培养箱中分别处理4h、8h、16h、24h、32h、40h、48h，以正常组细胞作为对照，采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况，western blot检测各种细胞中caspase-3及Bim蛋白表达情况，荧光定量逆转录多聚酶链反应（qRT-PCR）检测各组细胞中miR-24的表达情况；并据凋亡情况选择24h作为下一步转染实验的低温处理时间；（2）采用Lipofectarmine-2000介导转染，将人工化学合成的miR-24mimic及miR-24inhibitor转染心肌细胞，用荧光显微镜观察转染是否成功，采用qRT-PCR检测miR-24的表达情况判断转染效率；（3）经转染的心肌细胞并经低温处理24h后，同样用流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况，westernblot检测各种细胞中caspase-3及Bim蛋白表达情况，，荧光定量逆转录多聚酶链反应（qRT-PCR）检测各组细胞中miR-24的表达情况。 结果： （1）心肌细胞经低温处理4h、8h、16h、24h、32h、40h、48h后，与正常对照组相比细胞凋亡率逐渐升高，在24小时达到高峰（P＜0.05）；细胞凋亡的标记性蛋白caspase-3的表达也逐渐增加，在24小时达到高峰（P＜0.005）；miR-24的表达逐渐下降，在24小时达低峰（P＜0.01）；Bim蛋白的表达从16小时（即当miR-24的水平显著下降）开始逐渐升高，在24小时达高峰（P＜0.005）； （2）转染浓度为100nM时，miR-24mimic使miR-24的表达上调8倍，miR-24inhibitor使miR-24的表达下调79%（P＜0.005）； （3）与低温对照组相比，转染miR-24mimic组细胞经低温处理后凋亡明显减少（P＜0.01），caspase-3蛋白表达减少（P＜0.05），Bim的表达明显下降（P＜0.05）；而转染miR-24inhibitor组细胞经低温处理后凋亡明显增加，caspase-3蛋白表达增加，Bim的表达明显增加。 结论： 25°低温可诱导心肌细胞凋亡，miR-24能抑制低温诱导的心肌细胞凋亡，其机制可能与抑制促凋亡蛋白Bim的表达有关。
【关键词】：心肌细胞 低温诱导 凋亡 miR-24 Bim caspase-3
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 第1章 引言10-13
• 第2章 材料与方法13-26
• 2.1 实验材料13-16
• 2.1.1 试验细胞13
• 2.1.2 主要试剂13-14
• 2.1.3 试剂配制14-15
• 2.1.4 主要实验仪器15-16
• 2.2 实验方法16-25
• 2.2.1 细胞培养16-19
• 2.2.2 细胞冷应激模型建立19-20
• 2.2.3 细胞总蛋白提取20
• 2.2.4 细胞总 RNA 提取20-21
• 2.2.5 蛋白定量与质量鉴定21
• 2.2.6 RNA 定量与质量鉴定21-22
• 2.2.7 Annexin V/PI 双染法检测细胞凋亡22
• 2.2.8 qRT-PCR 法检测各组细胞中 miR-24 的表达22-24
• 2.2.9 Western Blot 检测 Bim 及 caspase-3 蛋白表达24
• 2.2.10 miRNA 转染实验24-25
• 2.3 统计学方法25-26
• 第3章 结果26-36
• 3.1 低温诱导心肌细胞凋亡26-29
• 3.1.1 镜下正常 H9C2 细胞形态鉴定26
• 3.1.2 低温诱导 H9C2 细胞凋亡26-28
• 3.1.3 低温刺激对凋亡标记性蛋白 caspase-3 表达的影响28-29
• 3.2 低温刺激对 Bim 蛋白及 miR-24 表达的影响29-32
• 3.2.1 低温刺激对 Bim 蛋白表达的影响29
• 3.2.2 低温刺激对 miR-24 表达的影响29-32
• 3.3 miR-24 抑制低温诱导的 H9C2 凋亡32-36
• 3.3.1 miR-24 转染效率的确定32-33
• 3.3.2 转染并低温处理后 miR-24 的表达33-34
• 3.3.3 转染后低温诱导 H9C2 细胞凋亡情况34-35
• 3.3.4 转染后低温处理与 Bim 及 caspase-3 蛋白表达35-36
• 第4章 讨论36-39
• 4.1 低温诱导心肌细胞凋亡36
• 4.2 miR-24 与 Bim 共同参与低温诱导的心肌细胞凋亡36-37
• 4.3 miR-24 抑制低温诱导的心肌细胞凋亡37-38
• 4.4 实验思路和方法完善38-39
• 第5章 结论39-40
• 致谢40-41
• 参考文献41-44
• 攻读学位期间的研究成果44-45
• 综述45-56
• 参考文献54-56

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 鲍晓明;程晓曙;黄晓;王耀晟;李菊香;洪葵;;低温致乳鼠心肌细胞损伤中Bim蛋白的作用及PI3K/Akt相关机制[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年24期

2 宋学立,钱令嘉,李风芝;冷应激对心肌细胞损伤的影响[J];解放军预防医学杂志;2001年02期

本文编号：840461