利用高通量测序技术研究电磁辐射加速秀丽线虫发育的分子机制及PCR扩增效率呈倒“S”形曲线降低规律的析因分析

发布时间：2017-09-14 23:00

  本文关键词：利用高通量测序技术研究电磁辐射加速秀丽线虫发育的分子机制及PCR扩增效率呈倒“S”形曲线降低规律的析因分析

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【摘要】：随着通信技术的迅猛发展，电力设备的广泛应用，家用电器的大量普及，生活环境中的电磁场(electromagnetic fields，EMF)急剧增加，对于公众的身心健康具有潜在的威胁。流行病调查结果显示，电磁辐射能够引起人类神经系统、心血管系统、免疫系统和生殖系统的功能异常。相关的实验研究结果表明，高强度的电磁辐射能够对生物体造成广泛的损伤效率，如热效率和非热效应。因此，电磁辐射对生物体的损伤效应及其分子机制的研究已经成为生物电磁学领域研究的重点。目前，电磁辐射生物损伤效应的研究取得了长足进步，但是电磁辐射生物效应的分子机制至今尚未阐明，严重影响了电磁辐射防护药物的研发以及相关防护标准和措施的制定，成为生物电磁学亟待解决的重要问题。本实验室为探讨电磁辐射生物效应的分子机制，建立了秀丽线虫的电磁辐射体系。前期研究结果表明，持续电磁辐射能够显著加速秀丽线虫的发育速度。因此，本研究在前期研究结果的基础上，采用高通量测序技术对线虫的转录组表达谱和microRNA表达谱进行测序分析，旨在筛选出线虫体内应答电磁辐射的靶基因和信号通路，揭示持续电磁辐射加速线虫发育的分子机制，从而为电磁辐射生物效应的分子机制研究提供新的思路和方向。此外，在运用实时荧光定量PCR(real-time fluorescencequantitative polymerase chain reaction，Q-PCR)技术和双重PCR技术验证转录组测序分析结果的可靠性时，我们发现扩增效率(amplification efficiency，Ea)是聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)中的一个重要参数，与PCR的实际应用密切相关。因此，对PCR扩增效率呈倒“S”形曲线降低的原因进行了深入探讨。主要研究结果如下： 一、利用高通量测序技术研究电磁辐射加速线虫发育的分子机制 目的：利用高通量测序技术筛选秀丽线虫应答电磁辐射的靶基因和信号通路，阐明持续电磁辐射加速秀丽线虫发育的分子机制，并探讨电磁辐射加速线虫发育的生物效应中是否存在非热效应。方法：根据电磁辐射组(1.75GHz，110V/m，20℃)，阴性对照组(20℃)和温度对照组(25℃)线虫的生长曲线，挑选4个样品(电磁组36h，温度对照组36h，阴性对照组36h和阴性对照组48h)进行转录组测序和microRNA组测序，，然后采用生物信息学方法对测序数据进行分析，比较电磁组36h与温度对照组36h样品之间差异表达的基因和microRNA，同时分析电磁组36h样品中特异表达基因及其功能。 结果：电磁组36h与温度对照组36样品之间共存在372个上调基因和18个下调基因，20个上调microRNA和16个下调microRNA；电磁组36h样品中共存在630个特异性表达的基因，主要参与线虫的表皮发育和蜕皮等生理过程；参与线虫体内Hedgehog信号通路的基因如grl-5，grl-7，wrt-1，ptr-18，ptr-16，wrt-2，grd-1在电磁组36h样品中特异性高表达，并且受到miR-230，miR-56和miR-57的负调控。 结论：电磁辐射加速秀丽线虫发育的生物效应中存在非热效应。电磁辐射可能是通过促进胶原及蜕皮相关基因的表达，从而加速线虫的发育。 二、双重PCR结合毛细管电泳验证转录组测序的分析结果 目的：将双重PCR与毛细管电泳技术相结合，建立一种验证转录组测序结果的新方法。 方法：根据前期转录组测序的分析结果，挑选8个差异基因作为靶基因，分别使用双重PCR结合琼脂糖凝胶电泳、双重PCR结合毛细管电泳以及实时荧光定量PCR进行验证，比较三者的验证率。结果：双重PCR结合琼脂糖凝胶电泳的验证率为50%；双重PCR结合毛细管电泳和实时荧光定量PCR的验证率均为100%。 结论：双重PCR结合毛细管电泳可作为转录组测序结果验证的一种有效方法。 三、PCR扩增效率呈倒“S”形曲线降低的原因分析 目的：揭示PCR扩增效率呈倒“S”形曲线降低的原因 方法：首先引入模板复性效率(renaturation efficiency，Er)表征模板复性反应(template renaturation reaction，TRR)发生的能力，并分析复性效率在整个反应过程中的变化规律；从热力学和动力学的角度，分析PCR反应和模板复性反应的驱动力以及两者竞争关系在整个反应过程的变化规律，从理论上探讨模板复性是否为扩增效率呈倒“S”形曲线降低的主要原因；采用Q-PCR技术研究模板浓度对扩增效率曲线和复性效率曲线的影响规律，从实验角度论证模板复性是否为扩增效率呈“S”形曲线降低的主要原因；探讨PCR平台期产生的原因，确定引物耗竭，底物耗竭，酶活性丧失以及酶活性饱和等因素是否为扩增效率降低降低的主要原因。 结果：模板复性效率在整个反应过程中的变化规律为“S”形曲线；理论分析和实验验证表明，模板复性是扩增效率呈倒“S”形曲线降低的主要原因是；在PCR反应的平台期，引物和底物并未耗竭，聚合酶没有饱和并保持较高活性，模板发生强烈复性。 结论：模板复性是扩增效率呈倒“S”形曲线降低的主要原因，同时也是PCR平台期形成的主要原因。
【关键词】：电磁辐射 秀丽线虫 高通量测序 双重PCR 扩增效率 复性效率
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R383.1
【目录】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 前言12-18
• 第一章 利用高通量测序技术研究电磁辐射加速线虫发育的分子机制1418-33
• 1.1 材料与方法18-25
• 1.2 结果25-30
• 1.3 讨论30-33
• 第二章 双重 PCR 结合毛细管电泳验证转录组测序的分析结果33-43
• 2.1 材料与方法34-37
• 2.2 结果37-41
• 2.3 讨论41-43
• 第三章 PCR 扩增效率呈倒“S”形曲线降低规律的析因分析43-66
• 第一节 模板复性是扩增效率呈倒“S”形曲线降低的主要原因44-55
• 3.1.1 材料与方法44-46
• 3.1.2 结果46-55
• 第二节 模板复性是 PCR 平台期形成的主要原因55-66
• 3.2.1 材料与方法56-61
• 3.2.2 结果61-66
• 讨论66-69
• 全文总结69-71
• 参考文献71-80
• 附录一 英文缩略词表80-81
• 附录二 主要溶液的配制81-83
• 附录三 主要仪器设备83-84
• 个人简历84-85
• 攻读学位期间发表或投稿的文章和专利85-86
• 致谢86-87
• 综述87-100
• 参考文献98-100

【参考文献】

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本文编号：852812