白念珠菌ORF19.2734和ORF19.3222基因功能研究

发布时间：2017-09-15 05:17

  本文关键词：白念珠菌ORF19.2734和ORF19.3222基因功能研究

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【摘要】：白念珠菌是临床常见的条件致病真菌，由于抗细菌药物的滥用，免疫缺陷病人增加等因素，使得真菌感染的发病率逐渐上升。因此针对白念珠菌的研究也越来越被临床重视。白念珠菌的致病力与其应对外界刺激，如药物、金属离子等方面密不可分。本课题选取了ORF19.2734等8个白念珠菌应激相关基因，通过同源重组的方法构建基因缺失菌来研究这些基因的功能。最终成功构建了ORF19.2734的基因缺失菌。通过Spots assay、生长曲线、激光共聚焦显微镜、菌丝诱导等方法考察其表型。类似于高等真核生物中的溶酶体，液泡是真菌和植物中特有的一种细胞器，能够在真菌细胞中发挥蛋白质转运、内吞、维持细胞内环境稳定、输送营养、维持菌丝形成能力和致病力等多方面的作用。液泡同时也能够对真菌细胞应对外界刺激起到重要的作用。本实验室前期构建了液泡相关基因ORF19.3222的基因缺失菌，通过研究其表型推测其为液泡膜上的硫转运蛋白。本课题同时使用ORF19.3222的基因缺失菌，进一步考察基因ORF19.3222的功能。通过透射电镜、激光共聚焦显微镜等方法考察基因缺失菌的细胞壁完整性；通过罗丹明6G外排实验、测定细胞麦角甾醇含量等考察基因缺失菌对唑类药物敏感性的改变的原因；通过考察对SO2、甲硫氨酸、半胱氨酸的敏感性考察其参与细胞硫的代谢途径。并在此基础上进一步使用表达谱芯片技术，分析和推测该基因的生物学功能。 第一部分结果表明液泡相关基因ORF19.2734敲除后可以提高菌株对唑类药物的敏感性，会导致菌株生长的减缓，但是对菌丝形成能力和液泡的形态不造成影响。通过实时定量PCR的方法，推测ORF19.2734基因可能通过下调MDR1、ERG11、ERG2基因，增加胞内药物浓度、降低Erg11p活性，从而提高对氟康唑的敏感性。 第二部分结果表明液泡相关基因ORF19.3222缺失菌细胞壁结构发生改变，甘露糖层变薄，葡聚糖层暴露增加，这些使得基因缺失菌更容易被巨噬细胞识别吞噬，造成毒力的下降。ORF19.3222缺失后在20min内细胞的外排增加，胞内麦角甾醇的含量降低，对SO2、半胱氨酸、甲硫氨酸敏感性增加，延迟细胞代谢产生H2S。表达谱芯片的结果与前期多次实时定量PCR的结果有相互印证，如硫转运通路中基因MET16表达上调，细胞表面GPI锚定蛋白PGA23表达上调、ALS9表达下调等，同时芯片结果还提示该基因与液泡膜上V-ATPase的活性有密切的关系。V-ATPase是维持细胞内部pH稳态的重要蛋白，V-ATPase活性的下降可以导致液泡pH的升高、菌丝形成能力下降等方面；同时，，细胞内麦角甾醇含量减少也会降低液泡膜V-ATPase活性，进而提高菌株对唑类药物的敏感性。ORF19.3222基因缺失菌在氟康唑刺激下，V-ATPase功能增强，体现在液泡酸化程度增加，编码V-ATPase亚基的基因VMA2、VMA13表达量上升；在无氟康唑刺激下，没有明显的差异。提示ORF19.3222基因缺失菌对唑类药物敏感性降低是由于V-ATPase活性的增强造成的。因此推测在白念珠菌液泡膜上硫转运途径与H+转运之间有密切的关联。 结论：ORF19.2734基因缺失菌通过下调MDR1、ERG11、ERG2基因提高了对氟康唑的敏感性。ORF19.3222基因对维持正常的细胞壁结构、维持毒力有重要作用。ORF19.3222基因参与细胞内硫以及含硫氨基酸的代谢过程，会影响细胞内V-ATPase的正常活性，从而导致对唑类药物敏感性的降低。
【关键词】：白念珠菌 液泡 硫转运蛋白 V-ATPase
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R379;R3416
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 缩略词表9-10
• 前言10-12
• 第一部分、液泡相关基因 ORF19.2734 功能研究12-25
• 一、实验材料与方法12-18
• 二、结果18-24
• 三、讨论24-25
• 第二部分、液泡相关基因 ORF19.3222 功能研究25-54
• 一、实验材料与方法25-30
• 二、结果30-49
• 三、讨论49-54
• 结论54-55
• 参考文献55-59
• 附 1 综述59-70
• 参考文献63-70
• 附 2 在读期间发表的文章70-71
• 致谢71

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 康烨;阎澜;姜远英;;白假丝酵母菌对宿主的应激反应[J];第二军医大学学报;2013年03期

2 姚响文;曹颖瑛;姜远英;;模式识别受体在白念珠菌感染中的作用[J];中国真菌学杂志;2013年01期

本文编号：854532