全氟辛酸对血脑屏障模型和星形胶质细胞内游离钙的影响研究

发布时间：2017-09-15 06:00

本文关键词：全氟辛酸对血脑屏障模型和星形胶质细胞内游离钙的影响研究

【摘要】：研究背景：全氟辛酸(Perfluorocaprylic acid, PFOA, C8HF15O2)是全氟化合物(Perfluorinated compounds,PFCs)中的代表性化合物,其化学性质非常稳定,且具有良好的疏水疏油性,从20世纪50年代开始就广泛应用于防火泡沫、纺织品、室内装潢、表面处理、工业清洗剂、表面活性剂、地板抛光剂及个人卫生用品等诸多民用和工业产品生产领域[1]。PFOA具有碳氟共价键结构,这一结构特性使其很难降解,可在环境介质中持久存在并被生物体富集。环境调查结果表明,全球范围内各类水体以及包括北极在内的所有野生动物血液中都存在PFOA污染[2]。人群调查资料显示,全球范围内各国家人体血液中均检测出较高水平的PFOA污染[3]。同时近年来不断曝光不粘锅和运动品牌服装的涂层中含有全氟化合物全氟辛酸,使得全氟辛酸的生物学毒性越来越受到重视。研究表明,PFOA可引起肝癌、肝氧化应激增强,影响脂肪酸结合及促进肝细胞凋亡[4]；可改变大鼠心肌细胞膜表面动作电位及钙通道,导致细胞内钙超载而引起心肌损伤[5]。PFOA也能引起雄鼠睾丸癌,雌鼠乳腺癌和卵巢病变[6]；可降低小鼠血清中IgG和IgM水平,降低T细胞和B细胞的免疫功能[7]。动物实验发现与PFOA理化性质相似的全氟辛烷磺酸(perfluoroocantane sulfoate,PFOS)可引起大鼠的惊厥和易激惹等神经毒性现象[8]。提示PFOA也可能引起神经毒性,但相关研究资料相对较少。由于中枢神经系统的敏感性和不可再生性,针对PFOA可能具有的神经毒性研究显得尤为重要。研究目的：通过PFOA对体外建立的血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)模型的透过性测试和对体外培养的星形胶质细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的影响入手建立二阶筛检模型,探讨PFOA对中枢神经系统的可能影响机制,揭示星形胶质细胞对化学物神经毒的转接作用模式,为神经毒物体外筛检模型课题中三阶模型的建立提供方法技术模块。方法：(1)分离出生24h内Wistar大鼠的脑微血管内皮细胞(brain capillary endothelial cells, BCECs)和星形胶质细胞进行体外培养,利用Ⅷ因子相关抗原抗体和Anti-GFAP对细胞进行免疫化学检测,鉴定传代细胞的纯度。 (2)将第三代BCECs和星形胶质细胞分别接种到细胞插板和12孔培养板内进行共培养建立BBB毒性筛检模型,当插板中BCECs相互融合时进行渗漏试验,测定渗漏试验阳性插板的跨内皮细胞阻抗(transendothelial electrical resistance,TEER)值,选取TEER值稳定的插板进入跨膜透过实验。 (3)利用刃天青法测定PFOA对BCECs和星形胶质细胞的IC50,确定染毒剂量。 (4)利用荧光黄染液进行跨膜透过实验,测定PFOA和空白对照组对BBB的通透系数Pe值,用以判断PFOA对BBB透过性的影响； (5)根据PFOA染毒剂量的不同分为高、中、低剂量组和空白对照组,利用Fura-2双波长荧光光度法测定不同染毒时间后各组星形胶质细胞内[Ca2+]i,通过比较各组之间的差异推测PFOA对星形胶质细胞内[Ca2+]1的影响。结果：(1)通过免疫细胞化学染色鉴定,传代细胞的纯度达到95%,满足实验要求。(2)BBB模型在BCECs接种后5-6d达到融合状态,渗漏实验呈阳性,TEER值较稳定,建立的BBB模型可用于通透性毒性测试。(3)PFOA对BCECs和星形胶质细胞的IC50分别为1.Ommol/L和0.83mmol/L。(4)测得PFOA染毒组的Pe值为(1.37±0.16)×10-3cm/min,同期对照组Pe值为(1.04±0.09)×10-3cm/min, PFOA染毒组对BBB的通透系数Pe大于对照组,其差异具有统计学意义。(5)星形胶质细胞内的[Ca2+]i随着PFOA染毒剂量的增高及染毒时间的延长而呈现增高趋势。与对照组的差异具有统计学意义。结论：PFOA可引起BBB通透性增高,存在潜在神经毒效应。也可引起大鼠星形胶质细胞的[ca2+]i增高,可能通过影响星形胶质细胞的钙稳态而发挥神经毒性。二阶筛检模型初步判断PFOA具有潜在神经毒性。
【关键词】：全氟辛酸 血脑屏障 星形胶质细胞 游离钙离子
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R-332;R96
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