云南西部HIV阳性者感染弓形虫基因分型的初步研究

发布时间：2017-09-16 09:03

  本文关键词：云南西部HIV阳性者感染弓形虫基因分型的初步研究

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【摘要】：弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内的寄生原虫，可寄生在宿主除红细胞外的所有有核细胞中，引起严重的人兽共患弓形虫病。弓形虫寄生宿主的种类非常广泛，呈世界性分布趋势，可以感染所有的温血动物，包括人类在内。弓形虫还是一种机会性致病寄生虫，当弓形虫感染人体后，免疫功能正常者大多表现为无临床症状的隐性感染；免疫功能低下或缺陷者，可出现严重的临床症状，甚至死亡。弓形虫感染妊娠期妇女后，可导致流产、畸胎、死胎等严重不良后果。弓形虫还可经过胎盘垂直传播，引起新生儿的先天性弓形虫病。继发弓形虫感染是AIDS患者最为常见的机会性感染疾病之一，引起AIDS患者严重的弓形虫脑病而致死。而随着HIV感染率逐年升高，弓形虫感染引起来的相关疾病越来越受到世界关注。 根据其对小鼠的致病力强弱可将弓形虫分为强毒株和弱毒株。通过对基因分析可将弓形虫分为3个主要基因型,I型为强毒株，II型和III型为弱毒株。随着对弓形虫基因型的研究不断进展，越来越多的重组或非典型基因型被发现，已初步形成了将弓形虫虫株分为多个基因型的观点。不同基因型弓形虫株之间的毒力、感染力等存在较大差异，对药物的敏感性也不同。通过对弓形虫株进行基因分型对弓形虫病的防治及其流行病学特征研究有着非常重要的意义。本实验收集云南省部分地区HIV阳性者血液，利用血液样本对云南省HIV阳性者感染弓形虫基因型进行研究，初步确定云南省HIV阳性者感染弓形虫基因型，为云南省HIV阳性者弓形虫病的防治提供重要参考。 1.研究目的： 了解云南西部HIV阳性者弓形虫感染的基本情况，初步分析并确定云南西部HIV阳性者感染弓形虫的主要基因型，从而为云南西部HIV阳性者弓形虫病的防治及其流行病学研究提供重要参考和理论依据。 2.研究方法： 2.1样本收集 收集云南西部大理白族自治州、保山市、德宏傣族景颇族自治州艾滋病防治机构的HIV阳性者血液样本，均经蛋白印迹(WB)试验阳性确证。 2.2弓形虫抗体检测 将收集到的HIV阳性者血液样本应用酶联免疫吸附试验（ELISA）进行弓形虫IgG和IgM抗体检测，筛选弓形虫IgG和或IgM阳性出标本。 2.3基因提取及扩增、回收、纯化 采用全血基因提取试剂盒对弓形虫IgG和IgM阳性的血液样品进行基因提取；引用国际上成熟的引物及巢氏PCR技术对弓形虫B1基因进行扩增，经两轮扩增后电泳，全自动凝胶成像分析系统分析。对弓形虫B1基因扩增阳性的样本，用凝胶回收试剂盒进行回收、纯化。 2.4酶切 用限制性内切酶Pm1I和XhoI对弓形虫B1基因扩增阳性产物进行酶切，酶切后电泳结果与弓形虫标准株进行对比、鉴定，确定基因型。 2.5测序 将弓形虫B1基因扩增阳性的产物进行回收、纯化后，挑选7份（1份弓形虫速殖子感染小鼠血、5份HIV阳性者血液样本、1份纯化弓形虫速殖子、）送到上海立菲测序有限公司和大连宝生物有限公司进行测序，测序结果与Genbank上注册的弓形虫株基因序列进行对比分析。 3.结果： 3.1血清抗体检测 本次检测共355份全血样本，其中弓形虫IgG抗体阳性132份，阳性率为37%；弓形虫IgM抗体阳性有10份，阳性率为2.8%；两者合起来的总阳性率为40%。本次检测共挑选出142份弓形虫抗体阳性的HIV阳性者全血样本。 3.2基因扩增及酶切 本实验成功扩增出B1基因的血样有33份，电泳成像后可见一大小约530bp的条带。随机挑选出12份标本与1份弓形虫标准基因I型株（RH株）进行酶切和对比，，酶切后电泳，13份标本均可见一大小为530bp左右的条带。借用国际实验结果：II型（Me49）和III（C56）型酶切时可见分别为400bp和130bp的两个条带，与本实验结果进行对比、分析。 3.3序列分析 将云南西部HIV阳性者感染弓形虫株、标准株（RH）和Genbank注册的弓形虫株基因序列进行对比分析，它们之间的碱基对差异主要有以下3处：在第11对碱基处Genbank注册的弓形虫株多出A；在第61对碱基处，Genbank注册的弓形虫株表现为A、G碱基对的缺失；在第230对碱基处，云南西部HIV阳性者感染弓形虫第3株为A，而其它虫株为G。 4.结论 4.1云南西部地区HIV阳性者弓形虫感染率较高。 4.2云南西部HIV阳性者感染弓形虫株酶切结果与国际标准基因I型株（RH株）一致，初步确定云南西部HIV阳性者感染的弓形虫基因型主要为I型。 4.3各弓形虫株B1基因之间的差异率非常小，但还是有部分弓形虫株的碱基对存在缺失或突变。 4.4云南西部HIV阳性者感染的弓形虫是否还存在其它基因型，还有待进一步研究。 5.本实验研究的创新点 本实验通过收集云南西部地区艾滋病防治机构的HIV阳性者血液样本，利用ELISA进行弓形虫抗体检测，选择弓形虫抗体阳性的血液样本进行基因提取、弓形虫B1扩增、酶切及序列分析，初步确定云南西部地区HIV阳性者感染弓形虫的基因型。本实验主要的创新点： 直接从全血标本中提取弓形虫基因并成功扩增出弓形虫B1基因。
【关键词】：HIV阳性 弓形虫 巢氏PCR 限制性内切酶 序列分析 基因分型
【学位授予单位】：大理学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R382.5
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 前言11-14
• 第一部分 云南西部 HIV 阳性者血液样本弓形虫 IgG 和 IgM 检测14-19
• 材料与方法14-17
• 结果17-18
• 讨论18-19
• 第二部分 云南西部 HIV 阳性者感染弓形虫基因型分析19-38
• 材料与方法19-29
• 结果29-34
• 讨论34-38
• 总论38-39
• 参考文献39-45
• 附录（攻读硕士期间发表的论文）45-46
• 综述46-54
• 参考文献50-54
• 致谢54

【参考文献】

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