肠病毒71型非结构蛋白3A定位机制的初步研究

发布时间：2017-09-17 03:40

  本文关键词：肠病毒71型非结构蛋白3A定位机制的初步研究

  更多相关文章： 肠道病毒71型 3A 感染性克隆 多克隆抗体 定位 ASNA1

【摘要】：肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)在全世界广泛流行,感染人类后可以引起手足口病以及中枢神经系统损害在内的一系列疾病。肠道病毒感染细胞后可以产生大量的囊泡结构作为病毒的复制工厂。胞内膜结构重构和这些囊泡产生的机制目前还不明确,可能与病毒非结构蛋白的功能有关。肠道病毒3A蛋白是一个囊泡膜结合蛋白,但它如何定位到膜,是否参与囊泡发生以及可能的机制还不是很清楚。 本论文研究内容主要包括三个部分： 第一部分：EV71全长感染性克隆质粒的构建。提取EV71RNA,通过逆转录得到cDNA,利用特异性引物分别PCR扩增3个首尾重叠的基因片段,克隆到pBluescriptII载体上,最后将三个目的片段按顺序依次克隆至pBluescript Ⅱ载体上,构建T7启动子控制的全长感染性克隆质粒,为以后该病毒的分子生物学研究奠定基础。 第二部分：EV713A蛋白的原核表达及抗体制备。PCR扩增的3A基因克隆到PET28a载体上构建原核表达质粒PET28a-3A并转化大肠杆菌,诱导表达3A重组蛋白,免疫小鼠制备3A抗体。结果显示3A蛋白主要以包涵体的形式存在；免疫荧光和、Vestern blot检测显示,制备的3A蛋白鼠源抗体可识别真核表达的EGFP-3A融合蛋白以及EV71感染细胞表达的3A蛋白,表明成功制备了特异性的EV713A蛋白的鼠源抗体。 第三部分：3A蛋白定位机制的初步研究。构建3a基因及其不同缺失突变体羧基末端GFP融合蛋白表达载体,转染RD细胞后分析在细胞中的定位。结果显示3A蛋白主要定位在细胞质中,且跨膜结构域(transmembrane domain, TMD)是3A蛋白定位到囊泡膜的信号。Co-IP实验表明细胞内的末端锚定结合蛋白ASNA1与3A蛋白相互作用,可能参与3A蛋白的定位。通过RNA干扰将ASNA1干扰后发现病毒的复制受到一定程度的抑制,进一步说明ASNA1可能对病毒的复制有影响。
【关键词】：肠道病毒71型 3A 感染性克隆 多克隆抗体 定位 ASNA1
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 第一章 前言11-18
• 1.1 小RNA病毒科简介11-12
• 1.1.1 小RNA病毒科特征11
• 1.1.2 小RNA病毒分类11
• 1.1.3 小RNA病毒基因组结构11-12
• 1.1.4 小RNA病毒基因组的复制和表达12
• 1.2 肠道病毒属简介12-13
• 1.2.1 肠道病毒属理化特性12-13
• 1.2.2 肠道病毒属分类13
• 1.3 EV71病毒简介13-14
• 1.3.1 EV71病毒发现及流行病学13
• 1.3.2 EV71病毒的复制13-14
• 1.3.3 EV71非结构蛋白3A14
• 1.4 蛋白质的跨膜转运方式14-17
• 1.4.1 蛋白质的两类跨膜转运途径14-15
• 1.4.2 共翻译转运途径15
• 1.4.3 翻译后转运途径15
• 1.4.4 TA蛋白质转运途径15-17
• 1.5 本课题研究的目的和意义17-18
• 第二章 EV71全长感染性克隆质粒构建18-28
• 2.1 实验材料18-19
• 2.1.1 试剂18
• 2.1.2 仪器18
• 2.1.3 质粒、菌株、病毒毒株和细胞18
• 2.1.4 溶液及培养基配方18-19
• 2.1.5 引物19
• 2.2 实验方法19-24
• 2.2.1 EV71病毒RNA提取19-20
• 2.2.2 逆转录合成病毒基因组cDNA20
• 2.2.3 质粒提取20-21
• 2.2.4 EV71基因组01、02、03三个片段的PCR扩增21-22
• 2.2.5 PCR扩增目的片段纯化22
• 2.2.6 目的片段和载体酶切22-23
• 2.2.7 目的片段与载体连接23
• 2.2.8 感受态细胞制备23
• 2.2.9 质粒转化过程23-24
• 2.2.10 重组质粒的筛选和鉴定24
• 2.3 实验结果与分析24-27
• 2.3.1 EV71基因组片断的PCR扩增24-25
• 2.3.2 重组质粒pBluescript-01/02/03的构建与鉴定25
• 2.3.3 重组质粒pBluescript-01-02的构建与鉴定25-26
• 2.3.4 重组质粒pBluescript-01-02-03的构建与鉴定26-27
• 2.4 讨论27-28
• 第三章 EV71非结构蛋白3A的原核表达与抗体制备28-36
• 3.1 实验材料28-29
• 3.1.1 试剂28
• 3.1.2 仪器28
• 3.1.3 菌株、质粒、病毒毒株和细胞28
• 3.1.4 溶液配方28-29
• 3.1.5 引物29
• 3.2 实验方法29-32
• 3.2.1 表达载体PET28a-3A构建29-30
• 3.2.2 融合蛋白诱导30-31
• 3.2.3 蛋白质Western Blotting鉴定31
• 3.2.4 3A抗体的制备31
• 3.2.5 Lipofactamine2000介导转染RD细胞31
• 3.2.6 细胞总蛋白提取31
• 3.2.7 细胞免疫荧光检测31-32
• 3.3 实验结果与分析32-35
• 3.3.1 3a基因的扩增32
• 3.3.2 原核表达载体PET28a-3A的构建与鉴定32-33
• 3.3.3 3A重组蛋白的表达与鉴定33-34
• 3.3.4 多克隆抗体制备与检测34-35
• 3.4 讨论35-36
• 第四章 3A蛋白定位机制的初步研究36-52
• 4.1 实验材料36-38
• 4.1.1 试剂36
• 4.1.2 仪器36
• 4.1.3 菌株、质粒、毒株和细胞36
• 4.1.4 溶液配方36
• 4.1.5 引物36-38
• 4.2 实验方法38-40
• 4.2.1 真核表达载体构建38-39
• 4.2.2 免疫共沉淀(Co-IP)39
• 4.2.3 干扰RNA合成39-40
• 4.2.4 TCID_(50)测定40
• 4.3 实验结果与分析40-50
• 4.3.1 3A不同结构域GFP融合表达载体的构建与鉴定40-42
• 4.3.2 3A蛋白在细胞中的定位42-46
• 4.3.3 3A蛋白定位机制研究46-48
• 4.3.4 ASNA1蛋白对病毒复制影响48-50
• 4.4 讨论50-52
• 参考文献52-56
• 硕士期间发表论文56-57
• 致谢57

【参考文献】

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1 薛青红,刘湘涛,张彦明,韩雪清,谢庆阁;口蹄疫病毒3A基因在大肠杆菌中的高效表达[J];微生物学报;2002年05期

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本文编号：867083