人胚胎干细胞向胰岛素阳性细胞诱导分化体系的优化

发布时间：2017-09-17 19:02

  本文关键词：人胚胎干细胞向胰岛素阳性细胞诱导分化体系的优化

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【摘要】：第一章人胚胎干细胞(hESCs)向胰腺内分泌前体细胞诱导分化的比较 目的：通过比较文献中已报道的效率较高的诱导方案,找到在本实验室条件下获得胰腺内分泌前体细胞的最佳诱导方案。 方法：体外诱导hESCs需要依次经历限定性内胚层、胰腺内分泌前体最终才会成为胰岛素阳性细胞,这是体内β细胞发育分化过程的重演。利用本实验室已经建立好的条件,将人胚胎干细胞诱导至限定性内胚层阶段。然后分三组分别用D'Amour、Hongkui Deng、Hosoya实验室报道的诱导方案将细胞往胰腺内分泌前体诱导。在诱导的第10天以及第13天收集样本,用免疫荧光、间标流式、real-time PCR等检测手段比较三种诱导方案获得胰腺内分泌前体细胞的效率。 结果：仅Hosoya小分子方案组在第10天至第13天的过程中PDX1十细胞的比例出现明显的上调；D'Amour组呈现显著下降趋势；Hongkui Deng组呈现基本持平状态。仅Hosoya小分子方案组在第10天至第13天能持续检测到较多的NGN3+细胞；D'Amour组呈现下降趋势,且NGN3+细胞比例很低；Hongkui Deng组几乎检测不到NGN3+细胞。 结论：仅Hosoya小分子方案能更好的将限定性内胚层细胞诱导为胰腺内分泌前体细胞(PDX1+NGN3+). 第二章人胚胎千细胞来源的胰腺内分泌前体细胞向胰岛素阳性(Ins+)细胞诱导分化的研究 目的：比较基础培养基：D/F-12、高糖-DMEM;成熟因子方案与HOsoya的小分子方案获得胰岛素阳性细胞的效率。 方法：利用第一章所得到的优势方案(小分子诱导方案),将hESCs诱导至胰腺内分泌前体起始阶段,即诱导的第10天。然后将细胞分为两大组,其中一组用成熟因子方案诱导,另一组继续用Hosoya实验室报道的小分子方案诱导；分别考察两种诱导方案下,基础培养基中不同葡萄糖浓度在诱导第18天获得Ins+细胞的差异。用免疫荧光、间标流式、real-time PCR等检测手段比较各方案获得Ins+细胞的效率。 结果：高糖-DMEM加成熟因子组在诱导的第18天获得Ins+细胞的效率最高,达27.43%±2.97%。D/F-12加成熟因子组、高糖-DMEM加小分子组和D/F-12加小分子组的Ins+细胞比例都不及21%。而追溯到诱导的第13天检测成熟因子和小分子组在表达胰腺内分泌前体阶段标记基因显示成熟因子组PDX1、NGN3、Beta2基因的mRNA的相对表达量是小分子组的数倍 结论：培养基中葡萄糖浓度对终末形成Ins+细胞效率在成熟因子组中高糖能促使p细胞增殖,低糖能使细胞内Ins含量增加；而在小分子组中无区别。在获得Ins+细胞效率上高糖-DMEM加成熟因子比小分子方案有优势,其原因可能并不是胰腺内分泌前体阶段,PDX1+NGN3+细胞数量的多少,而与其PDX1和NGN3表达量有关。推测PDX1、NGN3的表达可能存在一个阈值是激活其下游基因启动所必须的。 第三章人胚胎干细胞来源的胰腺内分泌前体细胞向胰岛素阳性细胞诱导方案的优化 目的：以高糖-DMEM加成熟因子诱导方案为基础优化人胚胎干细胞来源的胰腺内分泌前体细胞向胰岛素阳性细胞诱导方案 方法：利用第一章所得到的优势方案(小分子诱导方案),将hESCs诱导至胰腺内分泌前体起始阶段,即诱导的第10天。以第二章中高糖-DMEM加成熟因子诱导方案为基础进行分组,将成熟因子Betacellulin、Exendin-4、IGF-1进行自由组合,分为无因子组、单因子组、双因子组、三因子组。将细胞诱导至第18天,用免疫荧光、间标流式、real-time PCR等检测手段比较各方案获得Ins+细胞的效率。 结果：在诱导第18天获得Ins+细胞比例最高的三组分别为双因子组中的Exendin-4IGF-1、单因子组中的Exendin-4及IGF-1,其值分别为：32.63%±8.50%、31.60%±2.16%、30.63%±1.37%。其中单因子组中Exendin-4在real-time PCR检测的各项胰岛终末细胞标记基因的mRNA相对表达量与其余组相比明显要高。免疫荧光也直观的反应出其优势 结论：在高糖-DMEM加成熟因子诱导方案基础上优化后,高糖-DMEM加单因子Exendin-4在D18可获得31.60%±2.16%Ins+细胞,是目前在我们实验室条件下获得的最高诱导效率。
【关键词】：人胚胎干细胞 胰岛素阳性细胞、诱导
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 前言13-14
• 第一章 人胚胎干细胞(HESCS)向胰腺内分泌前体细胞诱导分化的比较14-26
• 1. 材料与试剂14-17
• 1.1 细胞14-15
• 1.2 试剂15-16
• 1.3 试剂-分子生物学16
• 1.4 主要仪器16-17
• 2. 方法17-20
• 2.1 人胚胎干细胞培养17
• 2.2 hESCs的诱导分化17
• 2.3 免疫荧光17-18
• 2.4 间标流式检测18-19
• 2.5 RNA的抽提和cDNA的合成19
• 2.6 real-time PCR检测19-20
• 3 结果20-24
• 3.1 hESCs的诱导分化20-21
• 3.2 免疫荧光染色结果21-22
• 3.3 间标流式检测结果22-23
• 3.4 real-time PCR检测基因表达结果23-24
• 4 讨论24-26
• 第二章 人胚胎干细胞来源的胰腺内分泌前体细胞向胰岛素阳性细胞诱导分化的研究26-39
• 1. 材料与试剂27-29
• 1.1 细胞27
• 1.2 试剂27-29
• 1.3 主要仪器29
• 2. 方法29-33
• 2.1 人胚胎干细胞培养29-30
• 2.2 hESCs的诱导分化30
• 2.3 免疫荧光30
• 2.4 间标流式检测30-31
• 2.5 RNA的抽提和cDNA的合成31-32
• 2.6 real-time PCR检测32
• 2.7 胰岛素阳性细胞中平均胰岛素含量测定32-33
• 3 结果33-38
• 3.1 hESCs的诱导分化33
• 3.2 免疫荧光染色结果33-34
• 3.3 间标流式检测结果34-37
• 3.4 real-time PCR检测基因表达结果37-38
• 3.5 胰岛素阳性细胞中平均胰岛素含量测定38
• 4 讨论38-39
• 第三章 人胚胎干细胞来源的胰腺内分泌前体细胞向胰岛素阳性细胞诱导方案的优化39-52
• 1. 材料与试剂39-41
• 1.1 细胞39
• 1.2 试剂39-41
• 1.3 主要仪器41
• 2. 方法41-45
• 2.1 人胚胎干细胞培养41-42
• 2.2 hESCs的诱导分化42
• 2.3 间标流式检测42-43
• 2.4 RNA的抽提和cDNA的合成43-44
• 2.5 real-time PCR检测44
• 2.6 免疫荧光44-45
• 3 结果45-50
• 3.1 hESCs的诱导分化45
• 3.2 间标流式检测结果45-47
• 3.3 real-time PCR检测基因表达结果47
• 3.4 免疫荧光染色结果47-50
• 4 讨论50-52
• 总结52-53
• 参考文献53-55
• 综述55-67
• 参考文献64-67
• 致谢67-68
• 个人简历68

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 Juan Domínguez-Bendala;Camillo Ricordi;;Present and future cell therapies for pancreatic beta cell replenishment[J];World Journal of Gastroenterology;2012年47期

2 刘国强;魏蕊;洪天配;;干细胞移植治疗糖尿病的研究进展[J];中国医学前沿杂志(电子版);2014年01期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 申晶;骨髓源间充质干细胞输注促进STZ诱导的糖尿病大鼠胰腺内α细胞向β细胞的转变：糖尿病治疗的新模式[D];中国人民解放军军医进修学院;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前3条

1 陈桃;hUCMSCs分化为IPCs后免疫原性的变化[D];暨南大学;2013年

2 吴海伟;体外诱导hUC-MSCs分化的微生物代谢物筛选及分离鉴定研究[D];安徽医科大学;2013年

3 余丹峰;体外胰岛细胞共培养及化学因子联合诱导NOD鼠iPSCs分化为胰岛素分泌细胞的实验研究[D];南方医科大学;2013年

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本文编号：871160