枯草杆菌蛋白酶的分离纯化、酶学性质及体外溶栓性质

发布时间：2017-09-19 04:30

  本文关键词：枯草杆菌蛋白酶的分离纯化、酶学性质及体外溶栓性质

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【摘要】：随着我国人口老龄化现象的日益严重，老年常发疾病血栓栓塞性疾病的发生也极为普遍，这种疾病也是当前致死率很高的病因之一，治疗这类疾病的主要手段则是溶栓疗法，而纤溶酶主要是催化血栓中的主要成分纤维蛋白水解，从而达到溶解血栓的目的，纤溶酶可来源于动物、植物、微生物，而微生物则是纤溶酶的主要来源，枯草芽孢杆菌是人类最早发现的细菌，由于它的生长环境多样，自身没有致病性，对高温、高热、电磁辐射、紫外线等具有很强抗逆性，它可利用的营养物质多种多样，且能直接将许多蛋白质分泌到培养基中，产生各种各样的酶，一直是生物界研究热点。 本文采用单因素实验对实验室保存菌种枯草杆菌的发酵培养基组分及发酵条件进行优化，对发酵液产生的枯草杆菌蛋白酶进行分离纯化，测定了枯草杆菌蛋白酶中具有纤溶活性蛋白酶的部分酶学性质，并研究其体外溶栓特点，为后续工作的展开奠定了基础。 1、为提高枯草杆菌蛋白酶的产量，采用单因素实验设计，通过摇瓶培养对枯草杆菌的发酵培养基及发酵条件进行优化，结果表明，优化后培养基（w/v）为：麦芽糖1%、蛋白胨2%、MgSO4·7H2O0.05%、CaCl20.02%、KH2PO40.4%；最适发酵条件为：初始pH7、温度37℃、接种量为1%，最佳培养时间为48h。 2、将枯草杆菌按最优发酵培养基进行发酵培养48h后，将发酵液进行4℃、4000rpm离心20min，然后将发酵上清液加入60%饱和度的硫酸铵进行盐析、透析后冷冻干燥得到粗酶粉，然后利用CM-sepharose Fast Flow对枯草杆菌蛋白酶进行分离纯化，纯化后得到纯酶进行SDS-PAGE验证，最后得到的酶分子量显示低于14.3KDa，且具有纤溶酶活性，前人文献中未见报道，，是一种新的溶栓酶。 3、为明确枯草杆菌蛋白酶的酶学性质，研究了温度、pH、金属离子对其稳定性的影响。结果表明，枯草杆菌蛋白酶的最适反应温度为60-70℃、温度稳定性范围为40℃以下、最适反应pH为7，pH稳定性范围为6-8，未发现能增强该酶活性的金属离子。 4、研究了枯草杆菌蛋白酶体外溶栓的特点，结果表明，枯草芽孢杆菌蛋白酶在体外具有良好的溶栓能力，且溶栓过程红细胞形态完整，对红细胞无损害，对酶浓度具有梯度依赖性，其分解纤维蛋白能力强，具有直接分解纤维蛋白的能力。 本文分离纯化的枯草杆菌蛋白酶具有纤溶和体外溶栓能力，具有重要意义，其具体性质及体内溶栓的能力及特点将是下一步实验须进行的内容，为临床溶栓医药的研究奠定基础。
【关键词】：枯草杆菌蛋白酶 分离纯化 酶学性质 体外溶栓
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 0 前言12-26
• 0.1 枯草杆菌及其应用12-15
• 0.1.1 枯草杆菌概述12
• 0.1.2 枯草杆菌的应用12-15
• 0.2 血栓疾病及其危害15
• 0.3 血栓形成及溶解机理15-18
• 0.3.1 凝血系统16
• 0.3.2 抗凝血系统16-17
• 0.3.3 纤溶系统及其抑制物17-18
• 0.4 溶栓药物研究现状18-22
• 0.4.1 抗血小板药物18
• 0.4.2 抗凝药物18-19
• 0.4.3 溶栓药物19-22
• 0.5 微生物来源溶栓酶研究进展22
• 0.6 纤溶酶酶活测定方法22-24
• 0.7 立题依据及研究意义24
• 0.8 研究意义24-26
• 1 枯草芽孢杆菌液体发酵条件的优化及发酵曲线的制备26-35
• 1.1 实验材料、试剂与仪器26-27
• 1.1.1 菌株26
• 1.1.2 培养基26
• 1.1.3 主要试剂26
• 1.1.4 主要仪器26-27
• 1.2 实验方法27-29
• 1.2.1 枯草杆菌蛋白酶活力测定27-28
• 1.2.2 培养基的优化28-29
• 1.2.3 菌株培养及生长曲线的绘制29
• 1.3 实验结果29-33
• 1.3.1 培养基优化结果29-32
• 1.3.2 枯草杆菌发酵曲线的绘制32-33
• 1.4 讨论33
• 1.5 本章小结33-35
• 2 枯草杆菌蛋白酶粗酶提取及分离纯化35-43
• 2.1 引言35
• 2.2 实验材料、试剂与仪器35-36
• 2.2.1 试剂35
• 2.2.2 主要仪器35-36
• 2.3 实验方法36-40
• 2.3.1 枯草杆菌蛋白酶粗酶的提取36
• 2.3.2 枯草杆菌蛋白酶的纯化36-40
• 2.4 实验结果40-41
• 2.4.1 枯草杆菌蛋白酶粗酶提取40
• 2.4.2 枯草杆菌蛋白酶纯化实验结果40-41
• 2.5 讨论41-43
• 3 枯草杆菌蛋白酶的性质研究43-51
• 3.1 材料、仪器、试剂43-44
• 3.1.1 材料43
• 3.1.2 主要仪器设备43
• 3.1.3 主要试剂43-44
• 3.2 方法44-46
• 3.2.1 酶学性质44-45
• 3.2.2 枯草芽孢杆菌蛋白酶的体外溶栓实验45-46
• 3.3 实验结果46-50
• 3.3.1 枯草杆菌蛋白酶的酶学性质46-48
• 3.3.2 枯草杆菌蛋白酶溶解血栓活力测定48-50
• 3.6 本章小结50-51
• 4 全文总结51-53
• 论文的创新点53
• 论文的不足之处53-54
• 参考文献54-59
• 英文缩略语59-60
• 致谢60-61
• 个人简历61
• 发表的学术论文61-62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 惠明;窦丽娜;田青;侯银臣;;枯草芽孢杆菌的应用研究进展[J];安徽农业科学;2008年27期

2 苑艳辉,钱和,姚卫蓉;鱼下脚料综合利用之研究近况与发展趋势[J];水产科学;2004年11期

3 和田恭尚;酶在洗涤剂中的应用现状及展望[J];日用化学工业;2005年01期

4 李莹;陈斌;何正波;;溶栓剂的研发现状及展望[J];重庆师范大学学报(自然科学版);2010年01期

5 袁洪水;张红丽;辛欣;朱宝成;;Bacillus subtilis Z-3菌株纤溶酶的分离纯化研究[J];河北农业大学学报;2010年06期

6 李明;双宝;李海涛;王晴;高继国;;枯草芽孢杆菌的研究与应用[J];东北农业大学学报;2009年09期

7 植绍权;早期尿激酶静脉溶栓治疗急性心肌梗死24例临床分析[J];第一军医大学学报;2005年11期

8 陈晔;陈跃;张文光;;枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ZY-1)溶栓酶的分离纯化及其酶学性质[J];福建医科大学学报;2008年02期

9 陈晓飞;杜迅;刘安邦;周伏忠;陈国参;;纳豆激酶酶学性质的初步研究[J];河南科学;2008年10期

10 陈晓飞;周伏忠;陈国参;谢宝恩;宁萌;;纳豆激酶酶学性质研究[J];河南科学;2010年01期

本文编号：879500