重组慢病毒pWPXLd-Raf载体的构建及鉴定

发布时间：2017-09-19 22:22

  本文关键词：重组慢病毒pWPXLd-Raf载体的构建及鉴定

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【摘要】：研究背景及意义 胰腺癌是恶性程度最高的肿瘤之一，在西方国家其死亡率排在恶性肿瘤类别的第4位。我国胰腺癌发病率逐年上升，近20年增长迅速。同时，胰腺癌的发病率与死亡率很接近，五年内生存率极低，在所有癌症生存率排行榜中排行最低。因此为了提高胰腺癌患者总的生存率，需要研究有效的新的治疗方法。其关键则在于加强基础研究，对其发病机理和分子生物学特性的进一步阐明，可有助于我们提高对胰腺癌的治疗水平。 Ras基因首先在鼠肉瘤病毒的子代病毒中发现，，在正常人细胞中有表达，目前人类细胞中有三种Ras存在：H-ras、K-ras及N-ras等类似的基因。Ras激活后介导细胞生长与分裂信号，点突变、基因插入及过度表达均可导致Ras激活。活化的Ras翻译成异常的Ras蛋白参与到肿瘤的发生发展中。在90%左右的胰腺癌中存在K-ras突变，提示Ras在胰腺癌的发生发展中起重要作用。但是目前Ras信号通路在胰腺癌发生发展中的作用还不清楚。 Ras-Raf-Erk是Ras的下游信号转导通路之一，由Ras连接的受体酪氨酸激酶（RTK）及胞浆激酶所构成的级联反应。Ras具有内源性GTP酶的活性，其活化后可催化GTP水解成GDP，传递上游信号。突变的Ras基因所编码的蛋白会引起下游通路持续激活，激活包括Ras-Raf-Erk在内的若干条信号转导通路，其中Raf是MAPK激酶激酶，其作用是磷酸化并激活下游底物MAPK激酶，其具有活化酪氨酸/苏氨酸残基的功能。Raf包括有A-Raf、B-Raf、C-Raf三种亚型，其中B-Raf是此通路中产生活性最强的激酶，在人类肿瘤细胞中有30多个点突变位点存在，是最有潜能的治疗靶点。 研究目的 本研究通过制作能特异性表达B-Raf蛋白激酶的慢病毒载体，用此病毒感染原代胰腺腺泡细胞，并验证慢病毒载体的表达水平。实验的下一步可用原代细胞注射于裸鼠胰腺体内，模拟制作胰腺癌动物模型。 研究方法 1.制作pWPXLd-Raf慢病毒载体，将重组质粒转化于感受态细菌中。 2.大量扩增和提取重组质粒。 3.包装慢病毒并浓缩病毒上清。 4.培养293T细胞及原代胰腺腺泡细胞。 5.构建质粒转染293T细胞，慢病毒感染胰腺腺泡细胞。 6.用蛋白印迹法验证磷酸化Erk蛋白激酶在两种细胞中的表达水平。 结果 酶切电泳法证明目的基因已插入构建慢病毒载体，浓缩慢病毒感染293T细胞及原代胰腺上皮细胞后，用蛋白印迹法方法证明其下游信号磷酸化Erk在两种细胞中的表达水平增高，重组载体能表达B-Raf蛋白激酶活性，构建成功。研究的下一步将已感染病毒的原代细胞原位注射于裸鼠胰腺上模拟肿瘤模型。 结论 重组慢病毒载体pWPXLd-Raf能特异性表达B-Raf蛋白激酶活性，构建成功。
【关键词】：胰腺癌 Ras-Raf-Erk B-Raf 慢病毒 腺泡细胞 动物模型
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R346
【目录】：

• 主要缩略词表5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 材料和方法14-27
• 结果27-32
• 附图32-33
• 讨论33-40
• 结论40-41
• 参考文献41-44
• 综述44-54
• 参考文献49-54
• 致谢54

【参考文献】

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1 冯小明;张杰;刘永生;陈豪泰;马丽娜;孙德惠;;慢病毒载体及慢病毒介导的RNA干扰[J];黑龙江畜牧兽医;2009年03期

本文编号：884241