桔青霉组蛋白去乙酰化酶基因Pci-RpdA和Pci-HdaA的克隆表达及特征分析

发布时间：2017-09-20 16:45

  本文关键词：桔青霉组蛋白去乙酰化酶基因Pci-RpdA和Pci-HdaA的克隆表达及特征分析

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【摘要】：背景：丝状真菌产生的次生代谢产物是新药的重要来源之一,很多有重要应用价值的抗生素、免疫抑制剂、抗癌药物等都是由真菌产生。其中,由桔青霉产生的聚酮类化合物美伐他汀是第一个被发现的他汀类化合物,它是HMG-CoA还原酶的有效的竞争抑制剂,从而抑制胆固醇的生物合成。美伐他汀通常作为微生物转化的底物,进一步合成普伐他汀,普伐他汀主要用于治疗高胆固醇血症,具有广泛的市场前景与消费需求。由于他汀类药物对人类经济和健康的巨大影响,桔青霉作为重要药用微生物资源,其代谢产物及其代谢调控机制被广泛研究。 真菌的次生代谢是一个复杂的多层次调控过程。次生代谢产物的生物合成不仅受到途径特异转录因子的调控,还受到全局性调控因子的调控。近年来对一些真菌物种进行的研究结果显示,染色体的表观遗传状态也直接调控真菌次生代谢相关基因簇的表达。染色体的表观遗传状态又被称为染色体异构现象,受到“组蛋白密码”操控,包括组蛋白的甲基化、乙酰化、磷酸化等。其中,组蛋白氨基酸末端的乙酰化与去乙酰化作为基因活化和抑制过程中的主要调控机制,成为表观遗传学的研究热点之一。乙酰化和去乙酰化分别由组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶进行可逆修饰,两类酶是组蛋白乙酰化和转录活性的调节者。组蛋白去乙酰化酶能够将染色体上的乙酰化位点去除,从而改变染色体的表观遗传状态,调控次生代谢产物基因簇的表达。近年以组蛋白去乙酰化酶为靶点的微生物育种和微生物沉默基因挖掘引起了科学家的关注：通过使用小分子表观遗传抑制剂对真菌中组蛋白去乙酰化酶活性进行抑制,或者在基因水平上对真菌组蛋白去乙酰化酶编码基因进行分子操作(如基因敲除),真菌的次生代谢行为发生明显变化,多种已知次生代谢产物表达得以提高,甚至激活了基因组中的沉默基因,使真菌产生了新的化合物,为发现新的具有药学研究价值的先导化合物提供物质基础。 目的：本实验选取桔青霉野生菌株ATCC38065,从ATCC38065中克隆得到两个分属不同分类家族的组蛋白去乙酰化酶编码基因Pci-RpdA和Pci-HdaA,并对其进行了体外表达的初探和生物信息学解析,为从表观遗传调控的角度对桔青霉进行分子操作提供候选基因和作用靶点,以期提高其主要代谢产物产量或激活沉默基因；检测Pci-RpdA和Pci-HdaA两个基因在不同发酵时期的相对表达情况,从而揭示两基因的转录表达特征,为研究其功能奠定基础；比较组蛋白去乙酰化酶编码基因在美伐他汀高产工业菌株IMB002中的序列差异,推断由序列差异所引起的酶蛋白高级结构的差异。 方法：本实验通过对多个真菌物种的组蛋白去乙酰化酶编码基因序列进行比较分析,设计简并引物,以桔青霉cDNA和DNA为模板,结合3'-race技术及套式PCR方法,克隆获取Pci-RpdA和Pci-HdaA的全长DNA序列和全长cDNA序列,使用大肠杆菌表达系统对编码基因进行体外表达,并通过在线分析工具及生物软件进行蛋白结构分析；采用实时荧光定量PCR检测Pci-RpdA和Pci-HdaA两基因在桔青霉野生菌株ATCC38065发酵过程中的转录表达特征；克隆工业菌株IMB002中Pci-RpdA和Pci-HdaA两基因DNA和cDNA全长序列,使用序列分析软件对两基因的核酸序列和蛋白产物进行序列对比与差异分析。 结果：本文成功从桔青霉野生菌株ATCC38065中克隆得到与Rpd3同源基因Pci-RpdA和与Hdal的同源基因Pci-HdaA。Pci-RpdA基因长2072bp,含4个外显子和3个内含子,cDNA开放阅读框长为1092bp,理论分子量为71.12kDa,预测等电点为4.61,编码639个氨基酸,与产黄青霉中Rpd3在蛋白水平的一致性达95%,蛋白结构显示了较为保守的组蛋白去乙酰化酶ClassⅠ家族结构特征；Pci-HdaA基因长3053bp,含15个外显子和14个内含子,cDNA开放阅读框长为2295bp,理论分子量为84.80kDa,预测等电点为5.38,编码764个氨基酸,与产黄青霉中Hdal在蛋白水平的一致性达89%,蛋白结构显示了较为保守的组蛋白去乙酰化酶ClassⅡ家族结构特征。 成功构建基于pET-28(+)的Pci-RpdA和Pci-HdaA基因的体外重组表达载体pET-28(+)-RpdA和pET-28(+)-HdaA。初步探讨了重组RpdA和重组HdaA在大肠杆菌中的表达形式,并成功纯化出重组RpdA蛋白。 实时荧光定量PCR分析表明,在桔青霉野生菌株发酵的不同阶段,Pci-RpdA基因的转录水平具有显著性差异,特别是在发酵前期转录水平相对较高,而在发酵中后期转录水平相对下调；基因Pci-HdaA在不同的发酵阶段转录水平也具有显著性差异,在发酵中后期基因处于相对较高转录水平,而在发酵前期基因的转录水平相对较低。 两基因在野生菌株ATCC38065和工业菌株IMB002中序列差异分析显示,由于Pci-RpdA基因序列在第170位和1786位核酸序列的突变,使得桔青霉野生菌株ATCC38065中第57位精氨酸和第596位脯氨酸,在桔青霉工业菌株IMB002中分别突变成了赖氨酸和丝氨酸。将两株菌中的Pci-RpdA进行二级结构预测,发现由于57位氨基酸的突变,在野生菌株ATCC38065中Pci-RpdA蛋白的第59-60位氨基酸残基所形成的卷曲结构,在IMB002菌株中形成了一个小的B-折叠结构；596位氨基酸的突变,对蛋白二级结构没有造成影响。由于基因序列在第718位和1141位核酸序列的突变,使得桔青霉野生菌株ATCC38065中第240位缬氨酸残基和第381位丙氨酸残基,在工业型菌株IMB002分别突变成了异亮氨酸和苏氨酸。240位氨基酸的突变,对蛋白二级结构没有造成影响。由于381位氨基酸的突变,在野生菌种ATCC38065中Pci-HdaA蛋白的第366-380位氨基酸残基所形成的α-螺旋结构,在IMB002菌株中缩短至366-377位。 结论：克隆了桔青霉的组蛋白去乙酰化酶基因Pci-RpdA和Pci-HdaA,为后续对桔青霉进行表观遗传育种奠定基础。得到了在大肠杆菌中重组表达的RpdA蛋白,为后续酶活表征该蛋白提供物质基础。详细了解了Pci-RpaA和与Pci-HdaA及其编码产物的结构特征,发现了Pci-RpdA在发酵前期相对高表达、Pci-HdaA在发酵中后期相对高表达的重要特征,为进一步研究两基因的功能提供理论依据。比较了两基因在野生菌株和工业菌株中的序列差异,为探讨组蛋白去乙酰化酶与菌株高产代谢产物的相关性提供研究线索,也为揭示真核生物中复杂的表观遗传调控机制提供研究素材。
【关键词】：桔青霉 组蛋白去乙酰化酶 基因克隆 特征分析 表观遗传
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3416
【目录】：

• 摘要6-9
• Abstract9-12
• LIST OF ABBREVIATIONS12-13
• 第1章 综述13-21
• 1.1 组蛋白乙酰化的表观遗传基础13-15
• 1.1.1 染色体结构、组蛋白修饰与基因表达调控13-14
• 1.1.2 组蛋白乙酰化位点14-15
• 1.2 组蛋白去乙酰化酶研究现状15-18
• 1.2.1 组蛋白去乙酰化酶的分类15-16
• 1.2.2 组蛋白乙酰化与人类健康16-17
• 1.2.3 组蛋白去乙酰化酶基因在真菌基因调控和发育中的作用17-18
• 1.3 表观遗传修饰与新药发现18-21
• 1.3.1 沉默基因与表观遗传修饰18-19
• 1.3.2 表观遗传育种-开发微生物药物新手段19-21
• 第2章 绪论21-23
• 2.1 本实验课题的提出21
• 2.2 本研究的内容目的及意义21-23
• 2.2.1 实验主要研究内容21-22
• 2.2.2 研究目的及意义22-23
• 第3章 实验材料与方法23-31
• 3.1 实验材料23-26
• 3.1.1 菌株与载体23
• 3.1.2 试剂与培养基23-24
• 3.1.3 引物、酶与试剂盒24-25
• 3.1.4 主要使用仪器25-26
• 3.2 实验方法26-31
• 3.2.1 基因组DNA和总RNA的提取26
• 3.2.2 紫外分光光度法检查总RNA含量26
• 3.2.3 RT-PCR26-27
• 3.2.4 扩增Pci-RpdA和Pci-HdaA基因核心片段27-28
• 3.2.5 Pci-RpdA和Pci-HdaA基因3’端快速扩增(RACE技术)28
• 3.2.6 扩增Pci-HdaA基因5’端序列(套式PCR)28-29
• 3.2.7 Pci-RpdA和Pci-HdaA基因全长克隆29
• 3.2.8 测序29
• 3.2.9 生物信息学分析29
• 3.2.10 Pci-RpdA和Pci-HdaA的重组载体构建与诱导表达29-30
• 3.2.11 qRT-PCR检测Pci-RpdA和Pci-HdaA基因表达量30
• 3.2.12 工业菌株IMB002中Pci-RpdA和Pci-HdaA基因全长克隆30
• 3.2.13 序列对比30-31
• 第4章 结果与分析31-55
• 4.1 Pci-RpdA和Pci-HdaA基因的克隆31-37
• 4.1.1 总基因组提取31
• 4.1.2 总RNA提取31-32
• 4.1.3 Pci-RpdA和Pci-HdaA核心片段的克隆32-33
• 4.1.4 Pci-RpdA和Pci-HdaA基因3’端cDNA序列克隆33-34
• 4.1.5 Pci-HdaA基因5’端片段扩增34-35
• 4.1.6 Pci-RpdA和Pci-HdaA基因的全长扩增及基因结构分析35-37
• 4.2 Pci-RpdA和Pci-HdaA的生物信息学解析37-43
• 4.2.1 Pci-RpdA和Pci-HdaA氨基酸序列分析37-40
• 4.2.2 Pci-RpdA和Pci-HdaA蛋白结构预测与分析40-42
• 4.2.3 Pci-RpdA和Pci-HdaA的同源性及进化树分析42-43
• 4.3 Pci-RpdA和Pci-HdaA的重组表达与纯化43-47
• 4.3.1 pET28a(+)-RpdA和pET28a(+)-HdaA载体构建与验证43-44
• 4.3.2 重组RpdA和重组HdaA的诱导表达初探44-45
• 4.3.3 重组RpdA的分离纯化45-47
• 4.4 Pci-RpdA和Pci-HdaA在桔青霉发酵过程中的转录特征分析47-50
• 4.4.1 桔青霉生长曲线的绘制47-48
• 4.4.2 Pci-RpdA和Pci-HdaA在菌株发酵过程中的qRT-PCR检测及分析48-50
• 4.5 工业菌株中Pci-RpdA和Pci-HdaA克隆及序列差异分析50-55
• 4.5.1 工业菌株中Pci-RpdA克隆及序列差异分析50-52
• 4.5.2 工业菌株中Pci-HdaA克隆及序列差异分析52-55
• 第5章 讨论55-61
• 5.1 Pci-RpdA的特征讨论55-56
• 5.2 Pci-HdaA的特征讨论56
• 5.3 高产菌株序列差异的相关性讨论56-58
• 5.4 总结与创新点58-59
• 5.5 展望59-61
• 参考文献61-65
• 在读期间发表论文及所获奖励65-67
• 致谢67-68

【共引文献】

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本文编号：889246