模拟肝脏组织微环境对人脐带间充质干细胞向肝细胞样细胞分化的影响

发布时间：2017-09-21 08:17

  本文关键词：模拟肝脏组织微环境对人脐带间充质干细胞向肝细胞样细胞分化的影响

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【摘要】：目的：体外条件下，采用组织块培养法分离培养人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs）。利用大鼠肝组织匀浆上清液（liver tissue homogenate supernatant, LHS）模拟肝脏组织微环境对人脐带间充质干细胞进行诱导培养，从细胞形态、肝细胞标志物甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、细胞角蛋白18（cytokeratin-18，CK-18）以及肝脏功能蛋白色氨酸2,3-加双氧酶（tryptophan2,3-dioxygenase，TPH2）表达等方面考察人脐带间充质干细胞在肝脏组织微环境中向肝细胞定向分化的能力，以期为临床应用干细胞治疗终末期肝病提供理论依据和实验基础。 方法： 1hUCMSCs的分离培养、表型及分化潜能鉴定 无菌条件下收集足月产胎儿的脐带并储存于0.9%的无菌生理盐水中。在超净工作台内用PBS洗去脐带中残余血液并剪为3-4cm的小段。沿纵轴剖开脐带，暴露并剔除脐动脉和脐静脉，分离脐带基质即华尔通胶（wharton’s jelly），将其剪为0.5-1.0mm~3的组织块。采用组织块培养法，加入含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养基10mL；置于37℃、饱和湿度、体积分数为5%的CO2的培养箱中培养。待细胞长至80-90%汇合后吸弃组织块，细胞进行传代培养。取处于对数生长期的第3代贴壁细胞制成单细胞悬液，采用流式细胞术检测hUCMSCs的间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）标志物的表达。取处于对数生长期的第3代贴壁细胞，消化收集，离心重悬，以2×10~4个/孔的密度接种于24孔板；分别采用成骨、成脂诱导培养基进行培养，14天后分别采用Von Kossa染色法检测钙化基质沉淀和油红O染色法检测脂滴。 2LHS诱导hUCMSCs向肝细胞样细胞分化 Sprague Dawley（SD）大鼠，2%戊巴比妥钠按3mL/kg腹腔注射麻醉，固定四肢，消毒皮肤。打开腹腔，分离下腔静脉和肝门静脉，结扎肝门静脉远端。从肝门静脉近端进针并固定，用4℃预冷的生理盐水自肝门静脉进行肝脏灌流，待肝脏体积增大、肝叶变白时开放下腔静脉以利于灌流液排出，共灌流约30min。灌流结束后取出肝组织置于冰上，剔除被膜及韧带。称取湿重，按150mg/mL加入DMEM/F12培养基；冰浴条件下进行肝组织匀浆。4℃，，15000g离心30min，取上清液，0.22μm滤器过滤除菌，分装，-70℃冰箱储存备用。 取处于对数生长期的第3代贴壁细胞，以1×105个/皿的细胞密度接种于直径为35mm塑料培养皿中，待细胞长至约80%汇合，吸弃培养基，加入诱导培养基（肝组织匀浆上清液）进行诱导培养。实验分组为6组：阴性对照组、阳性对照组、标准对照组，LHS诱导hUCMSCs3天，5天，7天组；选取单纯LHS作为阴性对照组，QSG-7701人肝细胞株作为阳性对照组，常规培养的hUCMSCs作为标准对照组。倒置显微镜下观察并记录各组细胞形态。提取上述各组细胞总RNA，采用RT-PCR方法检测肝细胞标志物甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、细胞角蛋白18（cytokeratin-18，CK-18）及肝脏功能蛋白色氨酸2,3-加双氧酶（tryptophan2,3-dioxygenase，TPH2）的mRNA表达情况。 取处于对数生长期的第3代贴壁细胞，以5×105个/瓶的细胞密度接种于25cm2塑料培养瓶中，细胞培养及实验分组同上。提取上述各组细胞总蛋白，BCA法测定各组样品的蛋白浓度。采用Westen blot方法检测肝细胞标志物AFP、CK-18及肝脏功能蛋白TPH2的表达情况。 3数据处理与统计分析 上述实验均重复三次，统计结果以mean±SD表示；应用SPSS13.0统计软件，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）继以Dunnett t test对数据进行统计分析。统计结果以P＜0.05视为差异具有统计学意义。 结果： 1hUCMSCs的分离培养、表型及分化潜能鉴定 倒置显微镜下观察，人脐带基质采用组织块培养法培养10-14天，可见组织块边缘有长梭形的成纤维样细胞长出；继续培养7-10天细胞长至80%-90%汇合，呈漩涡状或放射状排列。 流式细胞术检测结果显示：hUCMSCs高表达CD29、CD44、CD105、CD73、CD90等MSCs表面标志分子，不表达造血细胞标志物CD34、CD45及内皮细胞特征性表面标志分子CD31；也不表达人类白细胞抗原HLA-DR。表明hUCMSCs的免疫表型符合MSCs的免疫表型特征。 分化潜能鉴定结果显示：hUCMSCs经成骨诱导后，细胞逐渐由长梭形转变为不规则形细胞，经Von Kossa染色可见黑色钙基质沉淀。hUCMSCs经成脂诱导后，细胞逐渐由长梭形转变为肥大的圆梭形细胞，胞浆内可见透亮脂滴，油红O染色可见大量红色透亮脂滴。表明hUCMSCs具有向骨细胞和脂肪细胞分化的潜能。 2LHS诱导hUCMSCs向肝细胞样细胞分化 倒置显微镜下观察，hUCMSCs经LHS诱导培养3天后，梭形细胞开始减少，细胞两极回缩，胞体变短；诱导培养5天后，梭形细胞继续减少，部分细胞呈三角形或多角形；诱导培养7天后，大多数细胞呈不规则形或类圆形，核大而圆，类似肝细胞形态。 肝细胞标志物AFP、CK-18检测结果显示：与标准对照组相比，LHS诱导3天、5天、7天组AFP、CK-18在mRNA（RT-PCR）和蛋白质（Westernblot）水平表达均显著增强（P＜0.01）。其中，AFP的表达量在诱导5天时达到峰值，随后下降；CK-18的表达量随诱导时间延长而增加。 肝脏功能蛋白TPH2检测结果显示：与标准对照组相比，LHS诱导3天、5天、7天组TPH2在mRNA（RT-PCR）和蛋白质（Western blot）水平表达均显著增强（P＜0.01），其表达量随诱导时间延长而增加。 结论： 1体外条件下，采用组织块培养法可从人脐带基质中分离培养出具有MSCs生物学特征的人脐带间充质干细胞。 2人脐带间充质干细胞经肝组织匀浆上清液诱导能分化为具有肝细胞表面标志物的肝细胞样细胞。 3人脐带间充质干细胞经肝组织匀浆上清液诱导为肝细胞样细胞后高表达肝脏功能蛋白，提示其具有肝细胞功能。
【关键词】：人脐带间充质干细胞 诱导 分化 肝组织匀浆上清液 肝样细胞 甲胎蛋白 细胞角蛋白18 色氨酸2 3-加双氧酶
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 前言11-12
• 材料与方法12-20
• 结果20-22
• 附图22-28
• 附表28-29
• 讨论29-32
• 结论32
• 参考文献32-36
• 综述 脐带间充质干细胞向肝细胞样细胞分化的研究进展36-49
• 参考文献43-49
• 致谢49-50
• 个人简历50

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 王忠琼;李昌平;杜光红;钟晓琳;陈霞;;多种细胞因子诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化[J];中国组织工程研究与临床康复;2008年21期

2 陈军;刘玉侠;姜文华;韩光;姜文平;;体外诱导人脐带间充质干细胞向肝样细胞的分化[J];中国组织工程研究与临床康复;2010年49期

3 王宪英;吴红海;秦亚斌;侯艳宁;;脑组织匀浆诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞[J];中国老年学杂志;2012年07期

4 张世昌;王英杰;刘涛;李桂清;;脐带组织来源基质干细胞的肝细胞相关标志物分析[J];胃肠病学和肝病学杂志;2009年09期

本文编号：893374