人胚胎干细胞传代培养方法与其遗传稳定性的相关研究

发布时间：2017-09-21 08:32

  本文关键词：人胚胎干细胞传代培养方法与其遗传稳定性的相关研究

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【摘要】：人胚胎干细胞（Human Embryonic Stem Cells，hESCs）来源于胚胎发育过程中囊胚的内细胞团（Inner Cell Mass，ICM)。hESCs传代过程中具有自身的特性，，即，保持自我更新、增殖、自主分化以及多能性的特性。近些年，对于人胚胎干细胞的研究越来越受到科研学者的关注。 人胚胎干细胞研究的最终目的是应用于临床医学治疗，但其安全性需要提前明确。探索hESCs的遗传稳定性对其安全性研究至关重要。胚胎干细胞的遗传稳定性受到很多因素影响，例如，传代方法，传代时间等。随着hESCs长期传代培养，hESCs的遗传稳定性会出现发生改变。不同的传代方法，包括机械法以及酶法传代也会使其改变。传统的G显带鉴定法最早应用于检测hESCs的遗传改变，近来，单核苷酸多态性（SNP，Single nucleotide polymorphism）芯片由于其更加精准的检测被逐渐应用于hESCs。中华8芯片特别覆盖中国人特有的常见和稀有变异，能够精确地反应中国人的遗传变异特点。应用该芯片技术于中国人胚胎建立而成的干细胞系，可更有利于鉴定中国人干细胞的遗传稳定性变异。 本研究旨在探索适应于我中心hESCs的不同传代方法，并且应用SNP芯片分析hESCs长期培养过程中基因遗传的变化，最终为确认hESCs传代过程的遗传安全性提供理论依据及实践基础。本研究的主要创新点：.应用适合中国人遗传变异的Omni中华8芯片，检测利用中国人胚胎建立的人胚胎干细胞系的遗传学变异。 目的 探索适应于我中心人胚胎干细胞类型的不同传代方法，以及长期传代培养对其遗传稳定性的影响。 方法 1.利用郑州大学第一附属医院生殖医学中心来源新鲜废弃胚胎所建立的hESC系，均已经过全能性鉴定。采用传统的机械传代法，以及利用胰酶、Ⅳ型胶原酶法进行hESCs传代培养，传代后的hESCs种植于小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细胞按1：1混合的饲养层上。 2.分别提取Zh2系P35/P60代的基因组DNA，应用高分辨率Omni中华8芯片检测人胚胎干细胞基因组DNA，分析其分子遗传学变异。结果 1. Ⅳ型胶原酶传代法耗费时间较长，不宜掌控消化时间和接种密度；0.25％EDTA-胰蛋白酶消化hESCs成单细胞状态，接种于饲养层后不利于继续生长；机械法传代可以根据需要切割成大小不同的团块，并可以切除分化的或者状态偏差的细胞，更加适合hESCs传代。 2.利用中华8芯片对比我中心hESCs的Zh2 P35和Zh2 P60，可检测出1130个基因位点差异，930个差异基因的存在。其中19号染色体的变异最大，并且涉及多条通路，与细胞的代谢、分化、凋亡，神经、眼、肾脏、生殖等器官的发育，以及ECG、Ca等分子途径等相关。 结论 1.机械法传代相较于酶法传代更适应于我中心的人胚胎干细胞。 2.长期传代培养后人胚胎干细胞不能保持遗传稳定性，且存在基因遗传的变异。变异的基因涉及多条通路，通过分析可探知变异基因的生物学功能。
【关键词】：胚胎干细胞 传代 单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism)遗传稳定性
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文缩略词10-11
• 前言11-13
• 材料与方法13-22
• 1.1 主要实验仪器、试剂和耗材13-14
• 1.2 主要试剂配制14-16
• 1.3 主要试验方法16-22
• 结果22-26
• 1.hESCs 传代过程中不同传代方式的比较22-23
• 2.传代过程 hESCs 的遗传变异23-26
• 讨论26-32
• 1.不同传代方法的探索26-27
• 2.hESCs 传代对于遗传稳定性改变的影响27-28
• 3.基因芯片用于 hESCs 传代检测的意义28-32
• 结论32-33
• 参考文献33-36
• 综述 人胚胎干细胞传代及其遗传稳定性的研究进展36-46
• 参考文献42-46
• 个人简历46
• 攻读硕士学位期间发表的文章46-47
• 致谢47

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 杜娟,林戈,卢光t;人胚胎干细胞和分化细胞差别基因的筛选[J];遗传学报;2004年09期

2 王宁;王雅杰;;BRCA1基因相关的DNA修复通路异常与三阴乳腺癌化疗药物选择的关系[J];中国癌症杂志;2009年07期

本文编号：893453