拉喹莫德对实验性自身免疫性脑脊髓炎的防治作用及其免疫学机制研究

发布时间：2017-09-22 17:37

  本文关键词：拉喹莫德对实验性自身免疫性脑脊髓炎的防治作用及其免疫学机制研究

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【摘要】：目的：研究拉喹莫德（LQ）对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的防治作用，探讨LQ对EAE防治作用的免疫学机制。方法：将75只雌性Wistar大鼠随机分成5组：正常对照组、EAE对照组、LQ低剂量组、LQ中剂量组、LQ高剂量组，每组动物均15只。在造模开始的前三天，即对LQ低、中、高剂量组进行干预，分别予以LQ0.03mg/kg·d、0.06mg/kg·d、0.12mg/kg·d灌胃，正常对照组及EAE对照组予以生理盐水2ml/d灌胃。后使用粗制髓鞘碱性蛋白（MBP）加完全弗式佐剂皮下注射制作EAE模型，正常对照组皮下注射等量完全福氏佐剂。在造模后继续对LQ各剂量组进行治疗，连续一周。每天对各组Wistar大鼠进行神经功能障碍评分及记录，以神经功能障碍评分连续三天无加重、四肢瘫痪或濒临死亡时作为发病高峰期。同时记录Wistar大鼠的发病潜伏期和进展期。在发病高峰期处死动物，未发病和正常对照组在造模4周后处死。留取大鼠脑脊髓组织、眶静脉血和脾脏组织。大鼠脑脊髓组织作HE染色后行光镜观察，通过酶联免疫吸附法（ELISA）测定外周血单个核细胞（PBMC）分泌白细胞介素-4（IL-4）、γ干扰素（IFN-γ）、白细胞介素-17（IL-17）能力，通过流式细胞仪测定脾脏组织调节性B细胞（Bregs）的比例，通过ELISA测定脾脏细胞培养上清液中白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）含量。结果：（1）各组实验大鼠发病情况：正常对照组均无大鼠发病；EAE对照组大鼠全部发病，发病率为100%；LQ低、中、高剂量防治组发病率分别为80%、66.67%、60%。EAE对照组发病的潜伏期为10.27±1.67天，LQ低、中、高剂量组大鼠的发病潜伏期均有不同程度的延长，分别为15.67±1.95天、17.27±1.49天、20.73±1.58天，与EAE对照组比较，差异具有统计学意义（P0.01），且呈剂量依赖关系。EAE对照组发病进展期为6.47±1.19天，LQ低、中、高剂量组的发病进展期分别为5.40±1.12天、4.20±1.15天、3.00±0.93天，较EAE对照组时间缩短（P0.01或P0.05），呈剂量依赖关系。EAE对照组发病高峰期时神经功能障碍评分为3.73±1.39，LQ低、中、高剂量组发病高峰期时神经功能障碍评分较EAE对照组低，分别为2.40±1.72、1.60±1.60、1.07±1.22，LQ高、中剂量组与EAE对照组相比差异具有统计学意义（P0.01），LQ低剂量组发病高峰期神经功能障碍评分较EAE对照组低，但差异不具有统计学意义（P0.05）；高剂量组与低剂量组相比差异具有统计学意义（P0.05），LQ高剂量组发病高峰期神经功能障碍评分与LQ中剂量组相比差异不具有统计学意义（P0.05）；同时中剂量组与低剂量相比差异也不具有统计学意义（P0.05）。（2）各组实验大鼠脑脊髓组织病理学变化：正常对照组大鼠脑脊髓组织无病理学改变；EAE对照组和LQ低、中、高剂量组大鼠脑脊髓组织都出现了不同程度的白质脱髓鞘改变，大量炎性细胞聚集在脑和脊髓实质内的血管周围，典型者形成“袖套”样改变，伴有血管充血。聚集细胞以淋巴细胞为主，伴少量单核细胞。LQ各剂量组的白质脱髓鞘和炎性细胞侵润程度较EAE对照组减轻，且高剂量组减轻效果更明显。（3）各组实验大鼠发病高峰期外周血PBMC分泌IL-4、IL-17、INF-γ能力和IL-4/INF-γ值：EAE对照组PBMC分泌IL-4能力、IL-4/INF-γ值较正常对照组明显减低（P0.01），分泌IL-17、INF-γ能力较正常对照组升高（P0.01）；LQ低、中、高剂量组PBMC分泌IL-4能力、IL-4/INF-γ值较EAE对照组升高（P0.01），分泌IL-17、INF-γ能力较EAE对照组减低（P0.01或P0.05）；LQ高、中剂量组PBMC分泌IL-4能力、IL-4/INF-γ值较LQ低剂量组升高（P0.01），分泌IL-17、INF-γ能力较LQ低剂量组减低（P0.01或P0.05）；LQ高剂量组PBMC分泌IL-4能力、IL-4/INF-γ值较LQ中剂量组升高（P0.01），，分泌IL-17、INF-γ能力较LQ中剂量组减低（P0.01或P0.05）。（4）各组实验大鼠发病高峰期脾脏组织中Bregs的比例及培养上清液中IL-10、TGF-β的含量：EAE对照组脾脏组织中的IL-10+Bregs、TGF-β+Bregs比例和脾脏培养上清液中IL-10、TGF-β含量较正常对照组减少（P0.01）；LQ低、中、高剂量组脾脏组织中IL-10+Bregs、TGF-β+Bregs比例和脾脏培养上清液中IL-10、TGF-β含量较EAE对照组增高（P0.01或P0.05），LQ高、中剂量组脾脏组织中IL-10+Bregs、TGF-β+Bregs的比例和脾脏培养上清液中IL-10、TGF-β含量较LQ低剂量组增高（P0.01）；LQ高剂量组脾脏组织中IL-10+Bregs、TGF-β+Bregs的比例和脾脏培养上清液中IL-10、TGF-β含量较LQ中剂量组增高（P0.01）。（5）相关性分析：EAE对照组及LQ各剂量组发病潜伏期与发病高峰期IL-17呈负相关（P0.01），与IL-4、IL-4/INF-γ值、脾脏组织中IL-10+Bregs、TGF-β+Bregs的比例及培养上清液中IL-10、TGF-β含量呈正相关（P0.01）；EAE对照组及LQ各剂量组发病进展期与发病高峰期IL-17呈正相关（P0.01），与IL-4、IL-4/INF-γ值、脾脏组织中IL-10+Bregs、TGF-β+Bregs的比例及培养上清液中IL-10、TGF-β含量呈负相关（P0.01）；EAE对照组及LQ各剂量组发病高峰期神经功能障碍评分与发病高峰期IL-17呈正相关（P0.01），与IL-4、IL-4/INF-γ值、脾脏组织中IL-10+Bregs、TGF-β+Bregs的比例及培养上清液中IL-10、TGF-β含量呈负相关（P0.01）。结论：1.采用豚鼠粗制MBP可以诱导Wistar大鼠建立EAE模型，EAE大鼠临床症状明显，脑组织血管周围炎性细胞浸润和白质脱髓鞘明显，说明此方法可以成功建立EAE模型。2.EAE大鼠发病高峰期外周血PBMC分泌炎性细胞因子（IL-17、IFN-γ）增多，而分泌免疫抑制性细胞因子（IL-4）减少，导致Th1/Th2比例失衡，Th0分化向Th1漂移。3.Bregs对EAE大鼠有负性调节作用，其作用机制可能是Bregs通过分泌IL-10和TGF-β1等抑制性细胞因子或是通过与其他免疫细胞的相互作用来发挥负性调节作用。4.LQ可以降低EAE大鼠发病率、延长潜伏期、缩短进展期、减轻神经功能障碍和炎性细胞侵润评分，对EAE发病具有防治作用。5.LQ通过抑制EAE大鼠外周血单个核细胞炎性细胞因子的产生和促进免疫抑制性细胞因子（IL-4）的产生，从而纠正Th1/Th2比例失衡，促使Th0分化向Th2漂移。6.LQ可以通过升高EAE大鼠脾脏Bregs的比例，从而通过Bregs及其分泌的抑制性细胞因子（IL-10、TGF-β1）而发挥负性调节作用，从而达到对EAE的防治作用。
【关键词】：拉喹莫德 实验性自身免疫性脑脊髓炎 Th细胞 调节性B细胞 细胞因子
【学位授予单位】：泸州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R-332;R744.51
【目录】：

• 摘要4-9
• Abstract9-15
• 前言15-18
• 材料与方法18-25
• 1 实验材料与仪器18-19
• 2 EAE 模型制作及 LQ 干预19-21
• 3 取材21
• 4 临床观察及指标检测21-24
• 5 统计学处理24-25
• 结果25-39
• 1 各组大鼠的临床表现和测定指标变化25-29
• 2 各实验组大鼠脑组织和脊髓组织病理学变化29
• 3 各实验组大鼠发病高峰期 PBMC 分泌 IL-4、INF-γ、IL-17 的能力和 IL-4/INF-γ 的值（见表 5）29-33
• 4 各实验组大鼠发病高峰期脾脏 Bregs 分布变化（见表 6）33-35
• 5 各实验组大鼠发病高峰期脾细胞培养上清液 IL-10、TGF-β 的浓度变化（见表 7）35-37
• 6 各实验组大鼠发病高峰期免疫学指标与临床指标的相关性分析37-39
• 讨论39-55
• 1 EAE 模型的建立和评价39-40
• 2 CK 在 EAE 发病中的作用机制40-45
• 3 Bregs 在 EAE 发病中的作用45-48
• 4 LQ 在 EAE 发病中的防治作用48-55
• 结论55-56
• 参考文献56-70
• 英汉缩略词对照表70-72
• 附图72-74
• 致谢74-75
• 综述75-86
• 参考文献81-86

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

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3 黄丹琳;许自川;党西强;曾雪琪;何小解;易著文;何庆南;;儿童紫癜性肾炎肾组织Th1/Th2比值与肾脏微血管损伤的关系[J];中国当代儿科杂志;2011年04期

本文编号：902171