刚地弓形虫棒状体蛋白17的生物信息学分析、克隆表达及重组蛋白的免疫保护性研究

发布时间：2017-09-25 01:20

  本文关键词：刚地弓形虫棒状体蛋白17的生物信息学分析、克隆表达及重组蛋白的免疫保护性研究

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【摘要】：目的 用生物信息学方法分析刚地弓形虫棒状体蛋白17（TgROP17）的结构特性与抗原表位；克隆表达TgROP17基因，并对重组刚地弓形虫棒状体蛋白17（rTgROP17）进行纯化和抗原性分析；观察不同剂量rTgROP17滴鼻免疫小鼠诱导的免疫应答；观察最佳剂量rTgROP17抗弓形虫感染的保护作用；探讨rTgROP17作为弓形虫疫苗候选抗原的可能性。 材料与方法 第一部分：利用生物信息学在线分析程序并结合Gene Runner和DNAMAN软件分析预测TgROP17的理化性质、跨膜结构域、信号肽、可溶性、蛋白质翻译后修饰位点、二级结构和T细胞、B细胞抗原表位。 第二部分：提取弓形虫RH株速殖子总RNA，根据TgROP17基因的开放阅读框设计引物并引入Bam H I和Xho I酶切位点，RT-PCR扩增出目的基因经双酶切后连接入pGEX-6P-1载体中，重组质粒转化至大肠埃希菌（E. coli）DH5α，阳性菌落经PCR、双酶切和测序鉴定。将重组质粒pGEX-6P-1-TgROP17转化至E.coli Rosetta（DE3）并用IPTG诱导表达，用GST-亲和层析柱纯化目的蛋白，SDS-PAGE检测表达纯化产物。Western blotting鉴定重组蛋白及其抗原性。 第三部分：40只BALB/c小鼠随机分为5组，分别用15μg、25μg、35μg、45μg rTgROP17溶于20μl无菌PBS中滴鼻免疫小鼠，对照组用20μl PBS代替，于第0、14、21天各免疫1次。末次免疫后第14天，眼静脉丛采血并分离血清。收集鼻咽、阴道和小肠冲洗液，ELISA法检测以上冲洗液SIgA和血清IgG及其亚型。无菌取脾，培养rTgROP17或ConA刺激后的脾淋巴细胞，CCK-8法测定刺激指数(SI)。ELISA法测定脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5的含量。 第四部分：BALB/c小鼠40只随机分为2组，35μg rTgROP17溶于20μl无菌PBS中，于第0、14、21天各滴鼻免疫小鼠一次，对照组用等量PBS代替。末次免疫后第14天，分别用1×104速殖子（慢性感染，免疫组和对照组各8只）或4×104速殖子（致死性感染，免疫组和对照组各12只）灌胃攻击每只小鼠。观察和记录致死性感染小鼠30天内健康状况和存活情况。攻虫后30天，颈椎脱臼处死慢性感染小鼠，分离计数肝、脑组织内速殖子数。 结果 第一部分：TgROP17是由608个氨基酸组成的可溶性蛋白，理论等电点为9.55，分子量为69056.2，分子式为C3087H4879N889O875S19，半衰期为30h，无跨膜结构域和信号肽，有8个翻译后修饰位点，存在24个B细胞抗原表位，23个CTL细胞表位，24个Th细胞表位。 第二部分：RT-PCR扩增得到约为1850bp的产物,并成功构建重组质粒pGEX-6P-1-TgROP17。SDS-PAGE结果显示，表达纯化后获得相对分子量（Mr）约96kDa的可溶性重组蛋白。Western blotting结果显示，rTgROP17为带GST标签的重组蛋白，且能被兔抗弓形虫血清识别。 第三部分：25μg、35μg和45μg组血清IgG以及小肠、鼻咽和阴道冲洗液SIgA含量均显著高于对照组（P0.05或P0.01），其中35μg组最高；且各组血清IgG2水平较IgG1水平高。与对照组相比，25μg、35μg和45μg组脾淋巴细胞SI显著增高，差异有统计学意义（P0.05或P0.01）。25μg、35μg和45μg组细胞培养上清IFN-γ、IL-2含量均显著高于对照组（P0.05或P0.01），35μg组最高；35μg和45μg组IL-4含量高于对照组（P0.05）；IL-5含量各组间差异无统计学意义（P0.05）。 第四部分：慢性感染实验组肝组织和脑组织内虫荷（49.42±9.15×105/g和9.63±1.64×105/g）均显著低于对照组（120.62±16.7×105/g和18.91±3.24×105/g）（P0.01），，减虫率分别为59.17%和49.08%。致死性感染实验组30天生存率达75%，而PBS对照组小鼠为25%，两者生存曲线差异有统计学意义（P0.01）。 结论 生物信息学分析显示刚地弓形虫棒状体蛋白17（TgROP17）具有多个T细胞和B细胞抗原表位；我们成功构建重组质粒pGEX-6P-1-TgROP17，经诱导表达、纯化获得重组刚地弓形虫棒状体蛋白17（rTgROP17），证实了rTgROP17具有抗原性。rTgROP17滴鼻免疫小鼠有效诱导了黏膜免疫应答及系统免疫应答，35μg剂量组效果最佳。rTgROP17可有效诱导抗弓形虫感染的保护作用,是有前景的弓形虫疫苗候选抗原。
【关键词】：刚地弓形虫 棒状体蛋白17 生物信息学 基因克隆 重组蛋白 滴鼻免疫 黏膜疫苗 免疫保护性
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R382.5;R3416
【目录】：

• 缩略词7-9
• 摘要9-12
• ABSTRACT12-16
• 第一章 刚地弓形虫棒状体蛋白 2 家族疫苗候选分子的研究进展16-31
• 摘要16
• 引言16-17
• 1 棒状体蛋白 2（ROP2）17-19
• 2 棒状体蛋白 4（ROP4）19-20
• 3 棒状体蛋白 5（ROP5）20-21
• 4 棒状体蛋白 8（ROP8）21-22
• 5 棒状体蛋白 13（ROP13）22
• 6 棒状体蛋白 16（ROP16）22
• 7 棒状体蛋白 17（ROP17）22-23
• 8 棒状体蛋白 18（ROP18）23-24
• 结语24
• 参考文献24-31
• 第二章 刚地弓形虫棒状体蛋白 17（TGROP17）主要特性和抗原表位的生物信息学分析31-45
• 摘要31-32
• 前言32-33
• 材料和方法33
• 结果33-40
• 讨论40-42
• 参考文献42-45
• 第三章 刚地弓形虫棒状体蛋白 17（TGROP17）基因的克隆表达、纯化及免疫反应性分析45-61
• 摘要45-46
• 前言46-47
• 材料和方法47-54
• 结果54-58
• 讨论58
• 参考文献58-61
• 第四章 重组刚地弓形虫棒状体蛋白 17（RTGROP17）滴鼻免疫小鼠诱导的免疫应答61-75
• 摘要61-63
• 前言63-64
• 材料和方法64-68
• 结果68-71
• 讨论71-72
• 参考文献72-75
• 第五章 重组弓形虫棒状体蛋白 17（RTGROP17）滴鼻免疫小鼠抗弓形虫感染的保护作用75-84
• 摘要75-76
• 前言76-77
• 材料与方法77-79
• 结果79-80
• 讨论80-81
• 参考文献81-84
• 附录Ⅰ84-87
• 主要试剂的配制84-87
• 附录Ⅱ87-88
• ELISA 主要试剂溶液配制方法87-88
• 攻读学位期间发表文章情况88-89
• 致谢89-90
• 个人简历90

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：914547