MPLexon10基因新突变体慢病毒表达载体的构建

发布时间：2017-09-25 01:39

  本文关键词：MPLexon10基因新突变体慢病毒表达载体的构建

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【摘要】：目的： 通过构建野生型及突变型MPL exon10基因的慢病毒表达载体,包装含有各目的基因片段的慢病毒,为后续研究MPL exon10新基因突变体MPLA497-L498LVIAins的功能奠定基础。 方法： 1.构建MPLA497-L498LVIA ins及对照基因的真核表达载体 应用RT-PCR方法扩增MPL exon10新基因突变体(MPLA497-L498LVIA ins)及野生型MPL (MPLWT)的全长CDS编码区域,分别通过酶切、连接反应,构建其慢病毒表达载体并依次命名为pCDH1-MPLA497-L498LVIA ins及pCDH1-MPLWT重组质粒。以pCDH1-MPLWT的重组质粒为模板,通过定点诱变技术构建MPL热点突变体(MPLW515L)表达载体,并命名为pCDHl-MPLW515L重组质粒。 2.构建MPLA497-L498LVIA ins及对照基因的慢病毒表达体系 采用最佳的质粒配比比例,将构建成功的表达质粒分别与包装质粒pPACKH1-GAG,pPACKH1-REV和pVSV-G通过磷酸钙共沉淀法转染293T细胞,包装慢病毒颗粒,用激光共聚焦显微镜及流式细胞术检测转染效率。 3.慢病毒感染293T细胞,测定病毒滴度 收集的慢性毒浓缩液分梯度直接感染293T细胞,于96小时激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光表达,计数最后一个能观察到荧光的孔内的阳性细胞数,按公式计算病毒滴度(TU/ml)-最后一孔荧光细胞数/稀释倍数×103。 结果： 1.经酶切,测序鉴定,慢病毒表达载体pCDH1-MPLA497-L498LVIA ins、 pCDH1-MPLW515L和pCDH1-MPLWT重组质粒构建成功。 2.利用基因工程技术构建三种目的基因的慢病毒表达体系,经激光共聚焦显微镜及流式细胞术转染效率分别pCDH1-MPLA497-L498LVIA ins为75.2%、pCDH1-MPLW515L为81.4%和pCDH1-MPLWT为69.9%,三种慢病毒表达体系成功构建。 3.测定病毒滴度分别为MPLA497-L498LVIA ins4×108TU/ml, MPLW515L4×109TU/ml, MPLWT1×106TU/ml,满足后续实验需要。 结论： 本课题设计并成功构建MPLexon10新突变体-MPLA497-L498LVIA ins,热点突变MPLW515L及MPL野生型的慢病毒表达载体；建立了成熟的慢病毒包装技术,其所产生的病毒滴度较高,可以满足后续该新突变在细胞株以及小鼠模型功能实验研究。
【关键词】：MPL exon10突变 MPLA497-L498LVIAins MPLW515L 慢病毒载体 转染
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-11
• 材料与方法11-26
• 结果26-39
• 讨论39-42
• 结论42-43
• 参考文献43-45
• 综述45-55
• 参考文献51-55
• 个人简介55-56
• 致谢56-57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 罗师平,冷希岗;基于PCR的体外诱变技术[J];国外医学(生物医学工程分册);2005年03期

2 王淑艳;张愚;;慢病毒载体的设计及应用进展[J];中国生物工程杂志;2006年11期

3 刘柳;肖志坚;;骨髓增殖性肿瘤发病分子机制研究进展[J];中国实验血液学杂志;2011年01期

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本文编号：914648