Tat-TSP2HD融合蛋白的免疫学特性及其对日本血吸虫感染保护的研究

发布时间：2017-09-26 11:33

  本文关键词：Tat-TSP2HD融合蛋白的免疫学特性及其对日本血吸虫感染保护的研究

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【摘要】：血吸虫病作为严重危害人类健康、影响社会经济发展最重要的寄生虫病之一，一直受到高度关注。血吸虫病广泛流行于亚洲、南美洲、非洲等76个发展中国家，目前全球受威胁人口达7.79亿人，患病人数达2.07亿人。在我国流行的日本血吸虫病迄今仍然是我国重大公共卫生问题之一。目前，我国血吸虫病的防治手段是“以切断虫卵污染环境为关键措施，控制传染源为主的血吸虫病综合防治新策略”。这一综合防治措施取得了较好的防控效果，但是影响血吸虫病传播与流行的因素仍然存在。因此，研制安全有效的疫苗，获得化疗“短效”作用与疫苗接种诱导较“长效”的免疫预防作用相结合的双重效应是综合防治日本血吸虫病的重要目标之一。 血吸虫感染早期即可激活宿主的免疫系统，产生针对血吸虫童虫、成虫和虫卵抗原的获得性免疫应答。其中分泌IFN-γ的CD4~+T细胞在抗血吸虫保护性免疫应答中发挥着重要作用。在辐射致弱尾蚴感染小鼠获得高保护力的研究中发现，CD4~+T淋巴细胞介导的、IFN-γ依赖的免疫效应机制是其获得高保护力的重要原因。IFN-γ可激活巨噬细胞产生NO，可能是清除肺期童虫的重要效应因子。另一方面，研究亦认为血吸虫感染小鼠体内的CD8~+T细胞在血吸虫产卵前和产卵后以及血吸虫病的慢性期均能够被活化，通过分泌IFN-γ发挥调节作用。在疫苗诱导的保护性效应中，亦有研究提示CD8~+T细胞亦能够发挥一定的抗感染作用。 抗原提呈细胞（APC）特别是树突状细胞（DC）对血吸虫抗原的处理和递呈是宿主在感染血吸虫后产生获得性免疫的第一个关键步骤。DC将血吸虫抗原摄取、加工处理后，通过主要组织相容性复合物（MHC）分子Ⅰ类和Ⅱ类途径可诱导CD4~+T和CD8~+T依赖的保护性免疫应答。 将重组表达的血吸虫抗原转入到DC中，则能够直接地观察血吸虫抗原被DC加工处理后对T细胞的作用。Tat-PTD能够不依赖内吞作用而将蛋白等转导入细胞和组织内。本研究拟采用原核表达技术构建TSP2HD[日本血吸虫四跨膜蛋白2（Schistosoma japonicum Tetraspanin-2）第二亲水基团]和Tat-PTD的融合蛋白，以Western blot分析融合蛋白Tat-TSP2HD的血吸虫抗原特性；以细胞免疫荧光分析融合蛋白的蛋白转导功能；以流式细胞术和ELISA法分析融合蛋白对骨髓来源树突状细胞（Bone marrow-derived dendritic cells，BMDC）表面标志的表达和分泌细胞因子的作用；混合淋巴细胞反应（MLR）检测负载融合蛋白后的DC对同种异体CD4~+和CD8~+T细胞的刺激效应；以Tat-TSP2HD负载的BMDC、TSP2HD负载的BMDC和BMDC分别经足垫免疫C57BL/6J小鼠，1周后用尾蚴进行攻击感染，感染6周后剖杀，计数成虫数和虫卵数，HE染色观察肝脏病理变化，流式细胞术检测脾脏免疫细胞分型。 本研究获得如下主要结果： 1．构建原核表达质粒，诱导表达融合蛋白Tat-TSP2HD和TSP2HD。 根据Tat-PTD和日本血吸虫四跨膜蛋白基因第二亲水基团（TSP2HD）的核酸序列设计引物，PCR合成目的片段Tat-TSP2HD和TSP2HD。将目的片段定向克隆到表达载体pET-32a（+）的His标签蛋白下游，构建重组表达质粒pET-32a（+）-Tat-TSP2HD和pET-32a（+）-TSP2HD。将重组质粒转化到表达宿主菌BMRosetta（DE3）中获得含此重组质粒的转化菌株。经IPTG诱导表达出融合蛋白Tat-TSP2HD和TSP2HD。用Ni Sephrose6Fast Flow柱对融合蛋白进行纯化，获得纯化的融合蛋白，并用Endotoxin Removing Gel去除内毒素。 2．融合蛋白Tat-TSP2HD作为抗原可被日本血吸虫感染的小鼠血清所识别，具有特异性。 以日本血吸虫感染小鼠血清和正常小鼠血清作为一抗，进行Western blot鉴定。结果显示，Tat-TSP2HD和TSP2HD蛋白均能够与日本血吸虫感染的小鼠血清发生反应，可见一条明显的特异性反应条带，而与正常小鼠血清作用则无特异性条带出现。 3．融合蛋白Tat-TSP2HD能够穿透细胞膜进入体外培养的细胞内，具有蛋白转导功能。 将蛋白Tat-TSP2HD加入到293T细胞的培养液中共培养，，荧光显微镜观察蛋白进入细胞的情况。结果显示，与蛋白Tat-TSP2HD共培养的293T细胞胞质中出现较多的红色荧光，证明Tat-PTD能够介导融合蛋白进入细胞胞质中，发挥蛋白转导功能。 4．融合蛋白Tat-TSP2HD能够诱导BMDCs的活化和成熟。 流式细胞术检测表面标志结果显示，Tat-TSP2HD蛋白作用后能够显著刺激BMDCs各种表面标志的表达，且MHCⅠ、CD40、CD86的表达水平高于TSP2HD蛋白作用后；ELISA检测细胞因子表达结果显示，Tat-TSP2HD蛋白能够刺激BMDCs分泌较多的细胞因子IL-12p70和IL-10，且与TSP2HD蛋白相比，Tat-TSP2HD蛋白能够使BMDCs分泌更高水平的IL-10。 5．融合蛋白Tat-TSP2HD负载BMDCs能够显著刺激T细胞的增殖，且CD8~+T细胞的增殖水平显著高于TSP2HD蛋白负载BMDC组。 将融合蛋白Tat-TSP2HD负载的BMDCs与同种异体CD4~+和CD8~+T细胞进行混合淋巴细胞反应（MLR），3H-TdR掺入法检测T细胞增殖情况，结果显示蛋白Tat-TSP2HD负载DC能够有效刺激CD4~+和CD8~+T细胞的增殖，且CD8~+T细胞的增殖水平显著高于蛋白TSP2HD负载BMDCs组。 6．融合蛋白Tat-TSP2HD负载BMDCs免疫小鼠，攻击感染后，能够获得一定的保护力。 以Tat-TSP2HD负载的BMDCs、TSP2HD负载的BMDCs、PBS处理的BMDCs分别免疫小鼠，1周后用40±2条尾蚴进行攻击感染，6周后剖杀。结果显示，与PBS-DC对照组相比，Tat-TSP2HD-DC组获得36.56%（P0.05）的减虫率和23.58%的减卵率。肝脏病理显示，Tat-TSP2HD-DCs组的平均单个虫卵肉芽肿面积小于TSP2HD-DCs和PBS-DCs对照组。流式检测脾细胞免疫细胞分型结果显示，Tat-TSP2HD-DCs组小鼠中脾单个核细胞中Th1细胞、Th2细胞、CD8~+T细胞、Tc1细胞、Tc2细胞的比例均略高于TSP2HD-DCs和PBS-DCs对照组，但无统计学差异。 综上，本研究构建表达的融合蛋白Tat-TSP2HD具有血吸虫抗原的特异性和蛋白转导功能，能够有效地诱导未成熟DC向成熟DC的转化，蛋白负载DC在体内外均能活化CD4~+和CD8~+T细胞，发挥部分抗血吸虫感染的作用。
【关键词】：日本血吸虫 树突状细胞 蛋白转导结构域 四跨膜蛋白 2（TSP2）
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R383.24
【目录】：

• 中文摘要5-9
• Abstract9-13
• 前言13-16
• 第一部分 pET32a（+）-Tat-TSP2HD 载体构建与蛋白表达16-40
• 一、实验材料16-21
• 二．实验方法21-35
• 三、实验结果35-40
• 第二部分 Tat-TSP2HD 融合蛋白免疫学特性的研究40-55
• 一、实验材料40-43
• 二、实验方法43-49
• 三、实验结果49-55
• 第三部分 Tat-TSP2HD 融合蛋白对日本血吸虫感染保护的研究55-68
• 一、实验材料55-57
• 二、实验方法57-62
• 三、实验结果62-68
• 讨论68-72
• 小结72-73
• 参考文献73-80
• 综述80-89
• 参考文献86-89
• 附录89-90
• 致谢90-91

【参考文献】

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1 王宪锋,刘忠湘,李淑梅,缪军,李s

本文编号：923272