结核分枝杆菌CFP10基因密码子优化DNA疫苗的构建及免疫效应的评价
本文关键词：结核分枝杆菌CFP10基因密码子优化DNA疫苗的构建及免疫效应的评价
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【摘要】：目的：（1）构建包含密码子优化CFP10基因的结核DNA疫苗pVAX1/CFP10-o。 （2）初步评价该疫苗免疫小鼠所诱导的免疫效应。 方法：（1）根据小鼠和人的密码子使用偏好，使用Gene Optimizer软件对结核分枝杆菌CFP10蛋白的编码基因进行优化，但不改变其氨基酸的序列。优化后的CFP10基因序列由南京金斯瑞公司进行全基因合成并插入真核表达载体pVAX1，构建包含密码子优化CFP10基因的真核表达质粒pVAX1/CFP10-o。同时，从结核分枝杆菌H37Ra株基因组中，PCR扩增天然密码子CFP10基因，经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后，纯化后的酶切产物CFP10基因与经同样酶切处理的真核表达载体pVAX1连接，构建包含天然密码子CFP10基因的重组质粒pVAX1/CFP10，，用酶切及测序的方法鉴定pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10重组质粒构建是否正确。（2）以EcoRⅠ和HindⅢ将质粒pVAX1/CFP10进行双酶切获得CFP10基因，亚克隆至原核表达载体pET42a(+)中，构建原核表达质粒pET42a/CFP10，转化大肠杆菌BL21，在IPTG诱导下表达重组蛋白CFP10，获得的蛋白经His亲和层析柱纯化，并采用SDS-PAGE电泳和western blot对表达产物进行分析和鉴定。纯化后的蛋白再通过去细菌去内毒素试剂盒进一步纯化去除内毒素，并以鲎试验检测内毒素去除效果。（3）大量提取经鉴定正确的包含密码子优化CFP10基因的真核表达质粒pVAX1/CFP10-o及包含天然密码子CFP10基因的pVAX1/CFP10重组质粒，经梭华-SofastTM介导体外转染Hela细胞，并通过RT-PCR、间接免疫荧光法检测重组质粒是否能在真核细胞内表达；将pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10重组质粒以肌肉注射辅以体内电穿孔的方式体内瞬时转染小鼠骨骼肌，免疫组织化学法检测其在骨骼肌细胞内的表达情况。（4）将28只SPF级BALB/c小鼠分为4组，即pVAX1/CFP10-o组，pVAX1/CFP10组，pVAX1空质粒组，NS（生理盐水）组，分别以pVAX1/CFP10-o、pVAX1/CFP10、pVAX1质粒和NS经肌肉注射辅以体内电穿孔途径进行免疫，每2w加强免疫一次，共免疫3次。间接ELISA法检测初次免疫后0、2、4、6w小鼠血清中CFP10特异性抗体IgG的水平；ELISA法检测末次免疫后2w（第6w）小鼠血清中IFN-γ的浓度；ELISPOT法检测末次免疫后2w（第6w）小鼠脾淋巴细胞和重组蛋白CFP10共培养后产生IFN-γ的T淋巴细胞数量；流式细胞仪检测CFSE标记的末次免疫后2w（第6w）小鼠T淋巴细胞经重组蛋白CFP10刺激后的增殖动力学变化，用flowjo软件分析其增殖指数。 结果：（1）构建的pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10重组质粒，经酶切电泳鉴定均分别于约3000bp和300bp处各见1条带；测序结果显示插入基因序列均分别与设计的CFP10优化基因和结核分枝杆菌H37Rv株CFP10编码基因序列一致。（2）成功构建pET42a/CFP10质粒,经酶切电泳鉴定分别于约5900bp和300bp处各见1条带；测序结果显示插入基因序列与结核杆菌H37Rv株CFP10编码基因序列一致。转化有重组质粒的BL21（DE3）经过0.1mmol/L IPTG、37℃诱导6h，高效表达了占菌体蛋白总量40%的可溶性融合蛋白，经His亲和层析柱纯化后的相对分子量约为37KD的蛋白能与CFP10多克隆抗体发生特异性的结合反应，经ToxinEraserT M去内毒素试剂盒进行去除内毒素处理后，鲎试剂检测蛋白内毒素为阴性。（3）质粒转染真核Hela细胞后经RT-PCR检测结果显示pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10质粒组均得到预期的目的条带；间接免疫荧光结果显示pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10质粒转染的Hela细胞均可见特异性绿色荧光，且pVAX1/CFP10-o组荧光强度高于pVAX1/CFP10组，空质粒pVAX1组和NS组未见特异性绿色荧光；质粒转染小鼠骨骼肌细胞后免疫组织化学结果显示pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10组小鼠肌肉组织内均有棕黄色阳性颗粒，pVAX1/CFP10-o组多于pVAX1/CFP10组，pVAX1组和NS组未见明显的棕黄色阳性颗粒。（4）pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10组小鼠血清CFP10特异性IgG抗体水平检测显示随免疫次数的增多呈上升趋势，在相同的免疫时间内，pVAX1/CFP10-o组高于pVAX1/CFP10组。末次免疫后2w（第6w），两组IgG抗体水平达到最高，且pVAX1/CFP10-o组小鼠血清CFP10特异性IgG抗体水平明显高于pVAX1/CFP10组和pVAX1组及NS组（p㩳0.05），pVAX1/CFP10组高于pVAX1组及NS组（p㩳0.05），而pVAX1组和NS组小鼠血清CFP10特异性IgG抗体水平差异无统计学意义（p㧐0.05）；pVAX1/CFP10-o组小鼠血清IFN-γ浓度明显高于pVAX1/CFP10组和pVAX1组及NS组（p㩳0.01），pVAX1/CFP10组小鼠血清IFN-γ浓度高于pVAX1组及NS组（p㩳0.01），而pVAX1组和NS组小鼠血清IFN-γ浓度差异无统计学意义（p㧐0.05）；ELISPOT结果显示pVAX1/CFP10-o组斑点数明显多于pVAX1/CFP10组和pVAX1组及NS组（p㩳0.01），pVAX1/CFP10组斑点数多于pVAX1组及NS组（p㩳0.01），而pVAX1组及NS组斑点数差异无统计学意义（p㧐0.05）；各组T细胞的增殖指数检测显示pVAX1/CFP10-o组（2.89±0.39%）明显高于pVAX1/CFP10组（2.06±0.16%）（p㩳0.05），pVAX1/CFP10组明显高于pVAX1组和NS组（p㩳0.05），而pVAX1组和NS组之间差异无统计学意义（p㧐0.05）。 结论： （1）成功构建了包含CFP10基因密码子优化结核DNA疫苗pVAX1/CFP10-o和包含CFP10基因天然密码子的结核DNA疫苗pVAX1/CFP10。 （2）成功高效原核表达了可溶性CFP10重组蛋白并获得了无内毒素的纯化蛋白。 （3）转染pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10质粒的Hela细胞和小鼠骨骼肌均可有效表达CFP10蛋白，且转染pVAX1/CFP10-o质粒的Hela细胞和小鼠骨骼肌表达CFP10蛋白的效果更佳。 （4）结核DNA疫苗pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10均可诱导BALB/c小鼠产生CFP10特异性的体液免疫和细胞免疫应答，且pVAX1/CFP10-o DNA疫苗诱导产生的CFP10特异性的免疫应答水平更高。
【关键词】：结核分枝杆菌 CFP10基因 密码子优化 DNA疫苗 体液免疫应答 细胞免疫应答
【学位授予单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.911
【目录】：
- 中文摘要5-8
- Abstract8-12
- 前言12-15
- 材料与方法15-38
- 1. 材料15-19
- 2. 方法19-38
- 结果38-54
- 讨论54-60
- 结论60-61
- 参考文献61-67
- 致谢67-68
- 附录 A 英中文术语与缩略词对照表68-69
- 附录 B 常用试剂配制69-72
- 附录 C 个人简历和发表文章72-73
- 附录 D 结核 DNA 疫苗综述73-86
- 参考文献81-86
【参考文献】
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本文编号：925354
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