人参皂苷Rg1对体外培养人脐带血间充质干细胞衰老的影响

发布时间：2017-09-26 22:11

  本文关键词：人参皂苷Rg1对体外培养人脐带血间充质干细胞衰老的影响

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【摘要】：目的：建立D-半乳糖诱导人脐血间充质干细胞(hUCB-MSCs)衰老的模型,同时探讨人参皂苷Rg1(Rg1)预防hUCB-MSCs衰老的作用和可能的作用机制。方法：密度梯度离心分离脐带血单个核细胞,获取纯化的第5代细胞,衰老组采用终浓度D-半乳糖8g/L培养基至第7代诱导衰老,同量D-半乳糖处理48h诱导轻微衰老后,应用Rg10.01～3μmol/L抗衰老治疗72h。衰老预防组分别应用D-半乳糖8g/L加Rg10.01～3μmol/L作用72h。倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长情况,流式细胞术检测细胞表面分子与细胞周期,细胞免疫化学染色鉴定胞浆内蛋白表达情况,显微镜下测定细胞表面积和表达p-半乳糖苷酶细胞百分率,MTT法检测光密度值,绘制生长曲线,诱导培养后特色染色鉴定成脂与成骨细胞real time-PCR检测衰老相关调控基因与成脂、成骨相关基因表达。结果：①对照组、模型组以及Rg10.1μmol/L组均稳定表达CD44、CD105、CD90、CD73和胞浆的波形蛋白,不表达CD45、CD34、CD11b、CD19和HLA-DR。②与对照组相比,模型组hUCB-MSCs呈多角形,胞体变大；细胞表面积也明显增大(P0.05)；生长曲线明显压低,细胞倍增时间112h,而对照组为54.43h。模型组β-gal染色阳性细胞百分率明显高于对照组(P0.05)；hUCB-MSCs细胞周期明显阻滞于G0/G1期,G0/G1期细胞比例较高,增殖指数明显较低(P0.05)。③抗衰老治疗中,与模型组相比,MTT测定存活细胞OD值,Rgl0.1μmol/L和3μmol/L对衰老的hUCB-MSCs增殖无明显影响(P0.05)。④诱导hUCB-MSCs轻微衰老,与模型组相比,Rgl0.1μmol/L和3μmol/L治疗组hUCB-MSCs MTT测定的吸光度值均明显升高(P0.05)。⑤衰老预防处理后,与模型组相比,Rgl0.1μmol/L和3μmol/L(P0.05或P0.01)治疗组hUCB-MSCs MTT测定的OD均明显升高。模型组细胞较宽大扁平,细胞表面积比对照组和Rgl0.1μmol/L治疗组均增大(P0.05),Rgl0.1μmol/L治疗组次之；β-gal染色阳性细胞百分率也呈现相似的排序结果；模型组hUCB-MSCs倍增时间77.83h,Rgl0.1组为65.21h；流式周期分析各组未见明显差异。对照组、Rgl0.1组以及模型组hUCB-MSCs,均可诱导出成骨、成脂细胞。成骨诱导可见,对照组hUCB-MSCs形成茜素红染色阳性骨结节的面积要远大于模型组,Rg10.1组次之,模型组最低；Rgl0.1组成脂诱导油红染色阳性脂滴数量似低于模型组。⑥定量PCR结果显示,衰老预防处理后,与对照组相比,模型组P16、TBX2、ALDH1A3、CALR表达均具明显差异(P0.01),而P53和P21mRNA表达无显著改变；与模型组相比,Rgl0.1组P16、TBX2mRNA表达量具显著差异(P0.01)。hUCB-MSCs诱导向成骨与成脂细胞分化后,与对照组比较,诱导组RUNX2、ALP、OCN和PPARG、LPL mRNA表达均显著升高；与诱导组比较,模型组RUNX2、ALP、OCN明显降低,而PPARG、LPL mRNA表达则明显增高；与模型组比较,Rgl0.1组RUNX2、 LPL mRNA表达具显著差异(P0.05),与诱导组比较无显著差异(P0.05)；而ALP、OCN和PPARG mRNA表达与模型组之间比较无显著差异。结论：采用D-半乳糖8g/L培养两代,可成功诱导hUCB-MSCs衰老。Rgl不能治疗严重的hUCB-MSCs衰老,但可一定程度治疗hUCB-MSCs的轻微衰老,并从多方面产生衰老预防作用,这一作用的机制可能与P16、TBX2mRNA表达上调有关。
【关键词】：人脐血间充质干细胞 D-半乳糖 衰老 人参皂苷Rg1
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R285;R329
【目录】：

• 英文缩略词表3-5
• 目录5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 一、材料与方法14-24
• 1. 材料14-17
• 2. 方法17-23
• 3. 统计学处理23-24
• 二、结果24-42
• 1. 原代与P5内hUCB-MSCs形态特征24
• 2. 衰老组hUCB-MSCs主要生物学特征变化24-29
• 3. Rg1对不同程度衰老hUCB-MSCs增殖的影响29-32
• 4. Rg1衰老预防后hUCB-MSCs的主要生物学特征变化32-38
• 5. mRNA相对表达量变化38-42
• 三、讨论42-47
• 四、结论47-48
• 参考文献48-52
• 综述52-59
• 参考文献56-59
• 致谢59-60
• 作者简介60

【参考文献】

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9 周s，

本文编号：925997