syk、JNK调控单核细胞增生李斯特菌感染过程中炎症复合体活化机制的研究

发布时间：2017-09-26 22:41

  本文关键词：syk、JNK调控单核细胞增生李斯特菌感染过程中炎症复合体活化机制的研究

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【摘要】：目的 探讨脾源性酪氨酸激酶syk信号通路以及胞内其它常见蛋白激酶(如JNK,P38MAPK以及P13K等)信号通路在单增李斯特菌(LM)感染小鼠腹腔巨噬细胞过程中对炎症复合体活化与装配的作用。 方法 将小鼠腹腔巨噬细胞随机分为BAY处理组、SP处理组、SB处理组、WO处理组、未处理组以及阴性对照组(NI),每组设3个复孔。BAY处理组、SP处理组、SB处理组、WO处理组分别用syk抑制剂BAY117082,JNK抑制剂SP600125,P38MAPK抑伟制剂SB203580以及P13K抑制齐wotamine预处理小鼠腹腔巨噬细胞1h,除阴性对照组外,其余各组巨噬细胞感染野生型LM (WT-LM)24h, ELISA检测上清液中白细胞介素(IL)-18表达水平；免疫荧光观察细胞内炎症复合体的关键蛋白组分细胞凋亡相关蛋白ASC斑点(ASC-speck)的形成情况；Westernblot检测WT-LM感染小鼠腹腔巨噬细胞不同时相点蛋白syk以及JNK的磷酸化水平变化情况,同时使用LM的△hly和△hly::hly突变株感染细胞观察syk以及JNK蛋白的磷酸化水平变化。同时利用NLRP3炎症复合体的特异刺激物(ATP)刺激BAY处理组与SP处理组巨噬细胞3h,ELISA检测上清液中IL-18的水平；免疫荧光观察细胞内ASC-speck的形成情况；使用AIM2炎症复合体特异刺激物(Poly(dA：dT))及IPAF炎症复合体特异刺激物(鞭毛蛋白-flagellin)分别刺激SP处理组细胞,ELISA检测上清液中IL-18的表达水平。 结果 BAY处理组小鼠腹腔巨噬细胞感染LM后IL-18的表达水平与未处理组相比明显降低(P0.05),其它几种蛋白激酶抑制剂处理组中,只有SP处理组IL-18的表达水平与未处理组相比明显降低(P0.05),而且降低的程度与BAY处理组相似,而SB处理组和WO处理组小鼠腹腔巨噬细胞的IL-18表达水平与未处理组相比,差异均无统计学意义(P0.05),免疫荧光结果显示BAY处理组与SP处理组小鼠腹腔巨噬细胞经LM刺激后,胞内ASC-speck阳性的细胞百分比均明显低于未处理组(P0.01)。Western b1ot结果表明野生型LM感染过程中JNK的磷酸化水平10min时明显升高,在40min时达到最高水平,持续至少120min,同时syk的磷酸化水平在感染5min即可被检测到,进一步证实syk与JNK在LM感染过程中发挥着重要的作用。LM的△hly和△hly::hly突变株感染巨噬细胞过程中,JNK蛋白的磷酸化水平在△hly突变株感染后40min仍有显著表达,但在80min和120min出现骤然减弱,而syk磷酸化水平表达趋势发生变化,野生型LM和△hly: hly-LM感染组,p-syk的表达高峰均出现在感染后15min,在30min时表达量均减少,而△hly-LM感染组p-syk的表达高峰与野生型LM组p-syk的表达高峰相比,出现高峰延迟,高峰时间点出现在感染后30min时,结果表明,syk与JNK信号通路在调节LM感染后炎症复合体的过程中,LM的主要毒力因子LLO可能是其重要的调控靶点。为进一步探究JNK和syk信号通路是否特异性的促进LM感染过程中炎症复合体的活化,ATP刺激BAY处理组及SP处理组后发现,只有SP处理组的IL-18表达水平及胞内ASC-speck的百分比数量与未处理组相比明显降低(P0.05),而BAY处理组的IL-18表达水平与未处理组相比无明显变化；Poly(dA：dT)及鞭毛蛋白分别刺激SP处理组后,结果显示Poly(dA：dT)刺激实验中,SP处理组的IL-18表达水平明显降低(P0.05),而鞭毛蛋白刺激实验中的SP处理组IL-18水平与未处理组相比,差异无统计学意义。 结论 综上所述,syk信号通路及JNK信号通路参与调控单增李斯特菌感染过程中炎症复合体的活化,而且在调节过程中,syk和JNK蛋白磷酸化变化水平与LLO密切相关。而且,syk信号通路特异性地调控LM感染中炎症复合体的活化,而JNK信号通路可能非特异性参与NLRP3以及AIM2炎症复合体形成的过程中。
【关键词】：syk JNK 单增李斯特菌 炎症复合体 白细胞介素(IL)-18
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378;R3416
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 目录8-10
• 缩略语/符号说明10-11
• 前言11-18
• 研究现状、成果11-17
• 研究目的、方法17-18
• 1 对象和方法18-27
• 1.1 实验动物18
• 1.2 常规试剂和耗材18-19
• 1.3 各实验所需主要试剂及溶液的配制19-23
• 1.4 实验仪器和设备23-24
• 1.5 方法24-26
• 1.5.1 小鼠腹腔巨噬细胞的分离纯化24
• 1.5.2 LM野生株EGD和突变株的增殖与保存24
• 1.5.3 ELISA检测24-25
• 1.5.4 免疫荧光检测25-26
• 1.5.5 免疫印迹检测26
• 1.6 统计学方法26-27
• 2 结果27-34
• 2.1 不同抑制剂对LM感染小鼠巨噬细胞产生IL-18水平的影响27-28
• 2.2 SP处理和BAY处理对LM感染巨噬细胞胞浆内ASC-speck形成个数的影响28-29
• 2.3 LM感染不同时相点syk及JNK的蛋白磷酸化表达水平29-30
• 2.4 LLO在LM感染形成炎症复合体中的作用30-31
• 2.5 LLO对LM感染后syk及JNK蛋白磷酸化水平的影响31-32
• 2.6 syk和JNK信号通路在其他特异刺激物诱导的炎症复合体活化中的作用32-34
• 3 讨论34-38
• 结论38-39
• 参考文献39-44
• 发表论文和参加科研情况说明44-45
• 综述 炎症复合体在病原微生物感染中活化机制的研究进展45-54
• 综述参考文献51-54
• 致谢54

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

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中国博士学位论文全文数据库 前1条

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本文编号：926164