大鼠骨髓间质干细胞神经分化过程中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白表达的变化及意义

发布时间：2017-09-30 00:20

  本文关键词：大鼠骨髓间质干细胞神经分化过程中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白表达的变化及意义

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【摘要】：背景与目的 骨髓间质干细胞(marrow mesenchymal stem cells, MSCs)是一类可以从成熟骨髓、脐带血及脂肪组织等多种组织分离出来,具有多向分化潜能干细胞。MSCs具有很强的自我增殖、多向分化能力,在特定的条件下可以向不同的细胞进行分化,既可以向中胚层组织分化如骨细胞、心肌细胞等,又可以向外胚层组织分化如神经细胞等。MSCs具有来源方便、增殖能力强大、多向分化潜能等优点,因此在临床主要应用于血液系统疾病,心血管疾病,以及神经系统疾病的诊断与治疗。尤其是在神经系统疾病方面,MSCs的发现为神经系统变性病、中枢神经损伤等患者提供了新的治疗方法,具有长远的发展前景。诱导MSCs向神经细胞分化是一种横向的分化方式,存在着分化效率低、分化调节机制不明确等缺点,因此需要进一步研究。 TOR最初是在啤酒酵母的突变株TOR1和TOR2中发现的,TOR1和TOR2基因编码两个大的(280kDa)高度同源的(70%)TOR1和TOR2。1996年,(?)Abraham等在哺乳动物中也发现了结构和功能保守的TOR,称为mTOR。mTOR的C末端有一个激酶结构域,约234个氨基酸,因此被认为是磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶(PIKK)蛋白质家族成员。在哺乳动物中只有一个mTOR基因,在人、小鼠和大鼠中都编码2549个氨基酸,目前可以确定的是mTORC1至少包含mTOR、 raptor和mLST8三种蛋白,而mTORC2至少包含mTOR、rictor和mLST8三种蛋白。mTOR的上下游信号转导途径较为复杂,胰岛素、生长因子(胰岛素样生长因子,血小板源性生长因子和表皮生长因子等)合于跨膜胰岛素受体或酪氨酸激酶受体(IR,RTK)后,激活Ⅰ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(Class I PI3K),使PIP被磷酸化为PIP3,PIP3结合于Akt/PKB和它的活化分子PDK1。mTOR效应器4EBP1和S6Ks, mTOR活性抑制时,促进自噬体形成。PI3K/Akt/mTORCl信号通路是调控细胞生长与增殖的关键通路,该通路将营养分子、能量状态以及生长因子传来的信号整合在一起,调控大量的生命过程,包括自噬、核糖体的生物合成和代谢等。 因此本实验以骨髓间质干细胞为研究对象,通过不同浓度mTOR特异性抑制剂雷帕霉素的处理,观察骨髓间质干细胞神经分化前后mTOR表达的变化。并初步探讨大鼠骨髓间质干细胞神经分化过程中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表达的变化及意义。 材料和方法 实验分五组：骨髓间质干细胞空白对照组、骨髓间质干细胞β-巯基乙醇诱导组、不同浓度雷帕霉素干预骨髓间质干细胞组、不同浓度雷帕霉素干预骨髓间质干细胞+骨髓间质干细胞β-巯基乙醇诱导组、二甲基亚砜(DMSO)阴性对照组,雷帕霉素分3个浓度梯度：10μmol/L20μmol/L30μmol/L。常规体外培养大鼠MSCs,按照5×104cells/well比例接种于24孔细胞培养板,置于37°C、5%C02培养箱内培养。待细胞密度达70%～80%左右加入不同浓度的雷^ 霉素处理液(10～30μmol/L),且每组处理液DMSO浓度均低于0.1%,作用24小时。采用免疫荧光法检测诱导前后mTOR在细胞内的分布,激光共聚焦显微镜观察照相；Western Blot法检测诱导前后神经细胞相关蛋白和mTOR通路蛋白的表达。 结果 1、诱导前mTOR主要在骨髓间质干细胞细胞核内点状分布,细胞质也有少量的分布；诱导后核内荧光信号减弱,mTOR向细胞质转移。雷帕霉素处理后,随着雷帕霉素浓度的提高(10～30μmol/L),核内荧光信号减弱越明显,mTOR向细胞质转移越明显。雷帕霉素浓度超过50μmol/L后,细胞形态变圆,部分细胞脱壁,死亡率显著增加(P0.05)。 2、β-巯基乙醇可诱导骨髓间质干细胞分化为神经细胞,诱导后神经细胞Tau蛋白MAP-2蛋白表达显著增加。雷帕霉素(10～30μmol/L)干预后,随着雷帕霉素浓度(10～20μmol/L)的提高,Tau蛋白、MAP-2蛋白表达逐渐增加,30μmol/L时Tau蛋白、MAP-2蛋白表达下降(P0.05)。 3、Western blot检测结果提示,诱导前后总mTOR表达不变；磷酸化mTOR、磷酸化p70S6K、磷酸化4EBP1诱导后较诱导前表达下降(P0.05),不同浓度雷帕霉素干预后表达下调更加显著(P0.05)。 结论 mTOR在MSCs神经分化过程中由细胞核内向细胞质转移,活性下降,表达下调,且改变nTOR活性可影响MSCs向神经细胞分化。
【关键词】：骨髓间质干细胞 诱导 神经细胞 mTOR 雷帕霉素
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 缩略语一览表12-13
• 1 引言13-15
• 2 材料与方法15-25
• 3 结果25-30
• 4 讨论30-33
• 5 结论33-34
• 参考文献34-37
• 综述37-58
• 参考文献55-58
• 个人简历 在学期间发表的学术论文与研究成果58-59
• 致谢59

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 陈洪菊;唐彬秩;屈艺;母得志;;哺乳动物雷帕霉素靶蛋白参与神经系统损伤修复的研究进展及其延伸意义[J];中国修复重建外科杂志;2012年05期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 姜峰;钠通道位点3调制剂BmKI靶向性致痛的信号整合机制研究[D];上海大学;2012年

中国硕士学位论文全文数据库 前6条

1 李亮;脱氢表雄酮对Aβ_（25-35）小鼠海马神经再生的影响及其分子机制[D];南京医科大学;2010年

2 莫秋华;mTOR信号通路参与神经病理性疼痛脊髓背角突触可塑性调节的机制[D];中南大学;2011年

3 张振;NAC和雷帕霉素通过抑制镉诱导神经元氧化应激和mTOR通路激活抗凋亡机理研究[D];南京师范大学;2011年

4 杨文茜;脊髓mTOR信号通路在大鼠神经病理性疼痛中的作用[D];中南大学;2009年

5 胡凌云;ATP介导Akt/mTOR/p70S6K信号转导通路激活促进大鼠脊髓损伤后运动功能恢复[D];兰州大学;2010年

6 彭志勇;mTOR信号通路在神经病理疼痛大鼠脊髓背角突触可塑性的作用[D];中南大学;2010年

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本文编号：945086