乳鼠坐骨神经雪旺细胞体外培养的实验研究

发布时间：2017-10-01 03:21

  本文关键词：乳鼠坐骨神经雪旺细胞体外培养的实验研究

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【摘要】：目的： 1.探讨体外条件下乳鼠雪旺细胞的分离、培养和传代所需的条件,为进一步的转基因及移植提供种子细胞。 2.观察不同浓度脑源性生长因子培养环境下,雪旺细胞增殖与分泌情况。探讨脑源性生长因子(BDNF)影响体外培养的雪旺细胞增殖及分泌的实验研究。 方法： 1.将出生5-7天的乳鼠脱颈处死,在低温无菌条件下分离其双侧坐骨神经,双酶消化法制成单细胞悬液,加入10%FBS高糖培养基中,置于预先铺有多聚赖氨酸的培养瓶中培养,采用30分钟差速贴壁法初步去除成纤维细胞,将所得到的细胞悬液置于37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的培养箱中培养,24小时后,向培养基中加入终浓度为10-5/L阿糖胞苷进一步提纯雪旺细胞。24小时后换成含有foskilin和牛垂体提取物的培养基中进行培养。每日观察、记录雪旺细胞的生长状况,绘制生长曲线。将生长良好的雪旺胞进行传代,采用免疫荧光技术对其进行鉴定。 2.取出生5-7天的乳鼠坐骨神经的雪旺细胞,分别放入脑源性神经营养因子+10%胎牛血清+DMEM培养基中,按培养基中BDNF终浓度为0、10、20、50、100ng/ml,将雪旺细胞设立为5组培养1周,利用MTT法观察并比较雪旺细胞的生长增殖情况。ELISA检测不用浓度BDNF下,雪旺细胞分泌神经生长因子(nerve growth factor, NGF).睫状神经节营养因子(ciliary neurotrophic factor receptor,CNTF)的情况。 结果： 1.从乳鼠坐骨神经中分离出雪旺细胞。倒置显微镜下见培养的细胞24后开始贴壁,贴壁细胞多小而圆,较亮,折光较强,不随液体流动而移动,少量细胞呈双极索形或三角形,胞核成圆形或椭圆形,较多悬浮细胞。7-8天后,经过3次换液。细胞全部贴壁生长,细胞多呈双极索形,少量细胞呈三角形,相邻细胞之间以突起相连,或相互平行成束状排列。传代后细胞呈双极索行,贴壁生长。经S-100的免疫荧光染色鉴定,雪旺细胞多呈双极性,相互平行排列,纯度最高达80%。 2.BDNF终浓度为50ng/ml、100ng/ml组的雪旺细胞活力明显高于BDNF终浓度为Ong/ml的雪旺细胞的增殖活力,且差异有统计学意义(P0.05),而BDNF终浓度为10.20ng/ml组与终浓度为Ong/ml组相比,虽然雪旺细胞的活力有差异但无统计学差异(P0.05)。另外,雪旺细胞能够分泌NGF.CNTF,当BDNF终浓度为50ng/ml、100ng/ml与BDNF终浓度为Ong/ml比较,雪旺细胞的NGF、CNTF的表达水平明显增高,且差异有统计学意义(P0.05)。且当BDNF终浓度为50ng/ml时,雪旺细胞的NGF、CNTF的表达水平明显最高,但与100ng/ml组差异无统计学意义。(P0.05) 结论： 1.利用双酶消化神经组织成单个细胞后、加入阿糖胞苷抑制成纤维细胞生长、再加入foskilin促进雪旺细胞增殖是一种较为快捷、经济、实用的方法,可成功从乳鼠坐骨神经中获取雪旺细胞。经免疫荧光染色后,特异性表达S-100的雪旺细胞纯化后比例可达80%,可用于进一步的转基因实验或移植。 2.脑源性神经营养因子对体外培养的雪旺细胞有一定的促进增殖和分泌作用。
【关键词】：雪旺细胞 体外培养 神经营养因子
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要2-4
• Abstract4-8
• 引言8-9
• 第一部分 乳鼠雪旺细胞的分离、培养及鉴定研究9-17
• 1.1 材料9-11
• 1.1.1 实验动物9
• 1.1.2 主要设备和仪器9-10
• 1.1.3 主要试剂10
• 1.1.4 主要试剂配制及分装10-11
• 1.2 方法11-15
• 1.2.1 双酶消化+差速贴壁法11-12
• 1.2.2 组织块贴壁法12
• 1.2.3 酶消化+组织贴壁联合法12-13
• 1.2.4 原代雪旺细胞的传代13
• 1.2.5 雪旺细胞的鉴定13-14
• 1.2.6 计数法绘制雪旺细胞生长曲线14
• 1.2.7 MTT法绘制雪旺细胞增殖情况14
• 1.2.8 雪旺细胞的冻存14
• 1.2.9 实验中注意事项14-15
• 1.3 结果15-17
• 1.3.1 雪旺细胞的镜下观察15
• 1.3.2 雪旺细胞的免疫荧光鉴定结果15
• 1.3.3 计数法雪旺细胞的生长曲线15-16
• 1.3.4 MTT法雪旺细胞的增殖曲线16-17
• 第二部分 脑源性神经营养因子对雪旺细胞增殖和分泌的影响17-25
• 2.1 材料17-18
• 2.1.1 试验动物17
• 2.1.2 主要设备和仪器17-18
• 2.1.3 主要试剂18
• 2.2 方法18-20
• 2.2.1 雪旺细胞的原代培养和传代18-19
• 2.2.2 对雪旺细胞进行不同终浓度BDNF的处理19
• 2.2.3 MTT比色法检测雪旺细胞增值情况19-20
• 2.2.4 ELISA法检测不同终浓度的BDNF对雪旺细胞分泌NFG、CNTF的影响20
• 2.3 结果20-25
• 2.3.1 MTT法检测不同BDNF终浓度对雪旺细胞的增值及分泌的影响20-22
• 2.3.2 ELISA检测不同BDNF终浓度下,雪旺细胞分泌NGF、CNTF的水平22-25
• 第三部分 讨论25-28
• 1 动物的选择25
• 2 分离方法的选择25
• 3 提纯方法的选择25-26
• 4 雪旺细胞生长曲线的解释26
• 5 脑源性神经营养因子对雪旺细胞X椫臣胺置诘挠跋，
  
  本文编号：952040
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