非肽类活性生物大分子对细胞行为的影响

发布时间：2017-10-02 16:30

  本文关键词：非肽类活性生物大分子对细胞行为的影响

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【摘要】：非肽类活性生物大分子具有许多生物活性和生物功能，如传递遗传信息、控制胚胎分化、促进生长发育等。非肽类活性生物大分子分为核酸与多糖两类。其中，核酸主要包括DNA、RNA和核酸适配体(Aptamer, APT)。DNA、RNA可以通过基因转染的方式导入细胞内，从而通过其表达调控细胞行为；APT是一种核酸形式的抗体，它可以与具有纳米尺度的材料结合，通过对目的细胞的特异性识别结合作用，标记或者富集癌细胞，应用于生物医学领域。另一种非肽类活性生物大分子多糖同样具有许多生物学功能，它们参与了细胞间的识别和细胞与生物分子间的识别，尤其是磺化多糖可以调节各种生长因子和细胞因子的活性，进而调控干细胞的分化。研究表明磺化多糖中的肝素可以很好的调控胚胎干细胞的全能性和定向分化，但是肝素结构复杂，来源不同的肝素其生物活性也不同；而利用结构简单的壳聚糖通过磺化后可制备结构单一且具有类肝素作用的磺化壳聚糖，这种磺化壳聚糖同样可以调控细胞行为，及促进干细胞的分化。 正是由于非肽类活性生物大分子所具有的优点，我们选定APT和磺化壳聚糖用于研究生物大分子对细胞行为影响，以此来研究癌细胞富集以及干细胞分化，为早期癌症检测以及干细胞在生物医学领域的应用做一些基础研究。我们的研究主要分为两部分：血液中的癌细胞在核酸适配体修饰表面上的特异性粘附，磺化壳聚糖对胚胎干细胞定向分化的影响。 1，为了实现在血清环境中人体外周血癌细胞(CTC细胞)的特异性捕捉富集，我们在表面粗糙度递增的金纳米粒子聚集体（GNPL）表面上引入具有排蛋白效果的聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯（POEGMA）作为间隔臂，然后在POEGMA的末端羟基上修饰能与特定癌细胞特异性结合的核酸适体TD05，制备出功能化GNPL-POEGMA-APT表面，并考察癌细胞混合液中目的癌细胞——Ramos细胞在其表面上的特异性识别粘附效果。从实验结果中发现，在血清存在的复杂环境中，目的癌细胞Ramos细胞在GNPL-POEGMA-APT表面上具有较好的特异性识别结合能力，且这种能力随着表面粗糙度的增加而增加，GNPL3-POEGA-APT表面粘附的Ramos细胞密度能达到CEM的6.6倍。同时研究发现GNPL-POEGMA-APT表面粘附的癌细胞保持较好的细胞活性，而且GNPL-POEGMA-APT表面对目的癌细胞具有较好的特异性识别粘附效率；同时降低温度至4℃，我们研究发现目的癌细胞在GNPL-POEGMA-APT表面上的特异性识别粘附效率大幅增加。我们的研究表明这种功能化的GNPL表面在癌症早期诊断、癌细胞的分离与富集装置的制备等领域有着潜在应用前景。 2，特定结构的肝素可以控制胚胎干细胞的神经分化，但是肝素的磺化结构复杂，且不能人为控制。而肝素类似物—磺化壳聚糖可以简单的通过化学修饰来调控其磺化位点以及磺化度，且定位磺化壳聚糖可特异性吸附蛋白质。为验证磺化壳聚糖是否具有肝素的作用，我们对其进行了小鼠胚胎干细胞（mES）分化影响的研究。我们通过实验研究发现培养液中添加的不同位点的磺化壳聚糖有利于胚胎干细胞的神经分化，尤其是6S磺化壳聚糖具有肝素相似的效果。但是此研究使用的是正常的可细胞内生物合成肝素的mES，为更好的确定磺化壳聚糖对mES分化的影响，我们在实验过程中添加氯酸钠，抑制mES正常合成肝素，通过实验发现，外加的不同磺化位点的磺化壳聚糖对mES的神经分化有影响，其中6S最有利于胚胎干细胞的神经分化，且其效果与肝素相似；而且磺化度为0.83~0.81时，，6S更有利于胚胎干细胞的分化。我们的研究表明磺化壳聚糖有利于胚胎干细胞的定性分化，可应用于胚胎干细胞的分化与生物医学领域。 我们的研究表明通过非肽类活性生物大分子对细胞的行为调控，可以实现血液癌细胞的特异性粘附、小鼠胚胎干细胞的定向分化：特定的癌细胞可以特异性粘附在核酸适配体功能化的微纳米表面上；特定磺化度的6S可以促进胚胎干细胞的神经分化。虽然我们只是做了两方面的研究，但是非肽类活性生物大分子无疑在癌细胞富集、癌症诊断、生物医学等领域具有巨大的应用前景。
【关键词】：核酸适配体 特异性粘附 磺化壳聚糖 干细胞分化
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3416
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 绪论12-30
• 1.1 活性生物大分子12-13
• 1.2 核酸对细胞行为的影响13-21
• 1.2.1 DNA 与 RNA13-16
• 1.2.1.1 基因转染13-15
• 1.2.1.2 DNA、RNA 通过基因转染方式对细胞行为的影响15-16
• 1.2.2 核酸适配体16-21
• 1.2.2.1 核酸适配体简介16-17
• 1.2.2.2 核酸适体的优势17-18
• 1.2.2.3 核酸适配体修饰物对细胞行为的影响18-21
• 1.3 多糖对细胞行为的影响21-27
• 1.3.1 粘多糖对细胞行为的影响22-25
• 1.3.2 壳聚糖及其衍生物对细胞行为的影响25-27
• 1.4 课题提出27-30
• 1.4.1 研究目的及意义27-28
• 1.4.2 研究内容及研究方案28-30
• 第二章 癌细胞在改性金纳米粒子聚集体表面上的特异性粘附30-52
• 2.1 引言30-31
• 2.2 实验部分31-39
• 2.2.1 材料及试剂31-33
• 2.2.2 溶液配制33-34
• 2.2.3 金纳米粒子聚集体的制备34
• 2.2.4 POEGMA-APT 修饰表面34-35
• 2.2.5 材料表征35-37
• 2.2.5.1 水接触角测试35-36
• 2.2.5.2 表面元素分析36
• 2.2.5.3 厚度测量36-37
• 2.2.6 细胞培养以及细胞粘附实验37-39
• 2.2.6.1 细胞培养37
• 2.2.6.2 细胞特异性粘附实验37-38
• 2.2.6.3 表面粘附细胞密度的分析38
• 2.2.6.4 细胞活性实验38-39
• 2.3 结果与讨论39-50
• 2.3.1 材料表征39-41
• 2.3.1.1 元素分析39-40
• 2.3.1.2 材料的浸润性40-41
• 2.3.2 细胞在功能化表面的特异性粘附41-50
• 2.3.2.1 癌细胞在 GNPL-APT 表面的特异性粘附41
• 2.3.2.2 癌细胞在 GNPL-POEGMA-APT 表面上的特异性粘附41-46
• 2.3.2.3 癌细胞在改性表面上特异性粘附效率的研究46-48
• 2.3.2.4 细胞活性48-49
• 2.3.2.5 温度对癌细胞在改性表面上的特异性粘附的影响49-50
• 2.4 本章小结50-52
• 第三章 磺化壳聚糖对胚胎干细胞神经分化的影响52-74
• 3.1 引言52-53
• 3.2 实验部分53-65
• 3.2.1 材料与试剂53-55
• 3.2.2 培养液和溶液配制55-56
• 3.2.3 实验仪器56-57
• 3.2.4 磺化壳聚糖的合成57-60
• 3.2.4.1 不同磺化位点的磺化壳聚糖的合成57-59
• 3.2.4.2 制备不同磺化度的 6S59-60
• 3.2.5 磺化壳聚糖的测试与表征60
• 3.2.5.1 红外光谱60
• 3.2.5.2 元素分析60
• 3.2.6 胚胎干细胞分化实验60-62
• 3.2.6.1 胚胎干细胞60-61
• 3.2.6.2 胚胎干细胞的培养61-62
• 3.2.6.3 磺化壳聚糖对小鼠胚胎干细胞的分化实验62
• 3.2.7 免疫荧光染色62-63
• 3.2.8 聚合酶链式反应63-65
• 3.2.8.1 半定量 PCR 实验63-64
• 3.2.8.2 荧光定量 PCR64-65
• 3.3 结果与讨论65-73
• 3.3.1 磺化壳聚糖的结构表征65-67
• 3.3.2 不同定位的磺化壳聚糖对干细胞神经分化的影响67-68
• 3.3.3 磺化壳聚糖对干细胞神经分化的影响68-73
• 3.3.3.1 氯酸钠对小鼠胚胎干细胞的影响69-70
• 3.3.3.2 不同磺化位点的磺化壳聚糖对干细胞神经分化的影响70-71
• 3.3.3.3 6S 的磺化度对干细胞神经分化的影响71-73
• 3.4 结论73-74
• 第四章 结论74-76
• 参考文献76-91
• 硕士论文工作期间科研成果91-92
• 致谢92-93

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本文编号：960673