ANKIB1单克隆抗体的制备和ANKIB1表达分析

发布时间：2017-10-02 17:28

  本文关键词：ANKIB1单克隆抗体的制备和ANKIB1表达分析

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【摘要】：目的 1、制备抗人ANKIB1的小鼠单克隆抗体。 2、分析ANKIB1在人类细胞系和脑组织中的表达情况。 方法 在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达GST-ANKIB1(1-480)重组蛋白。利用谷胱甘肽琼脂糖4B柱亲和层析纯化GST-ANKIB1(1-480),以纯化蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术建立可分泌抗人ANKIB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。按常规方法制备腹水,分别利用抗体纯化试剂盒和抗体分型试剂盒纯化抗体并鉴定抗体的亚类,分别运用Western blotting、免疫沉淀、免疫荧光细胞化学和免疫细胞化学技术验证抗ANKIB1抗体的生物学用途,并分析ANKIB1在多种人类细胞系中的表达、细胞定位及其在人(鼠)脑中的表达情况。 在大肠杆菌BL21(DE3)中分别表达GST和GST-ANKIB1蛋白,使用谷胱甘肽琼脂糖4B柱分别纯化GST和GST-ANKIB1蛋白,将人胎脑蛋白溶液先与结合了GST的谷胱甘肽琼脂糖4B柱混合,从中清除GST相互作用蛋白,然后利用已结合GST-ANKIB1的谷胱甘肽琼脂糖4B柱从经过预清除的脑蛋白溶液中富集ANKIB1相互作用蛋白。 使用Protein G-小鼠IgG亲和层析柱从人胎脑蛋白中预清除与小鼠IgG相互作用的蛋白,然后利用Protein G-ANKIB1抗体亲和层析柱从经过预清除的脑蛋白中富集与ANKIB1相互作用的蛋白。 结果 1、获得了两株能够稳定分泌ANKIB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F9和7A9,所分泌抗体能够识别人、大鼠、小鼠的ANKIB1。 2、ANKIB1单克隆抗体可以运用于ELISA、Western blotting、免疫沉淀、免疫荧光细胞化学和免疫细胞化学技术。 3、ANKIB1在人类不同细胞系中均有表达,主要以122kDa和95kDa两种分子量的蛋白为主,其中前者与我们预测的理论分子量相一致,表达水平明显比后者高,后者可能是ANKIB1蛋白的一种亚型。 4. ANKIB1在HEK293细胞的细胞质和细胞核中均有分布,但细胞核中水平较高。 5、利用GST沉降和免疫共沉淀技术从人胎脑中富集到了ANKIB1相互作用蛋白。 结论 成功制备了ANKIB1单克隆抗体,该抗体可以应用于ELISA、Western blotting、免疫荧光细胞化学、免疫细胞化学和免疫沉淀等实验。ANKIB1在人类不同细胞系和脑组织中广泛表达,但表达方式和表达水平有明显差异。ANKIB1在HEK293全细胞中均有分布,在细胞核中的表达水平高于细胞质。从人胎脑蛋白中纯化出了大量ANKIB1相互作用蛋白,为研究ANKIB1的功能和分子机制奠定了基础。
【关键词】：ANKIB1 单克隆抗体 表达 细胞定位 蛋白相互作用
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 前言8-11
• 1 材料和方法11-25
• 1.1 材料11-15
• 1.1.1 实验动物及胚胎11
• 1.1.2 菌株和细胞株11-12
• 1.1.3 试剂12
• 1.1.4 质粒载体及引物12-13
• 1.1.5 抗体13
• 1.1.6 试剂盒13
• 1.1.7 主要耗材13-14
• 1.1.8 主要缓冲液14
• 1.1.9 主要仪器设备14-15
• 1.2 方法15-25
• 1.2.1 ANKIB1单克隆抗体的制备15-19
• 1.2.2 ANKIB1的内源性表达和定位19-21
• 1.2.3 ANKIB1相互作用蛋白的筛选21-25
• 2 结果25-40
• 2.1 单克隆抗体的制备25-33
• 2.1.1 抗原的表达和纯化25
• 2.1.2 免疫小鼠血清效价的测定25-26
• 2.1.3 杂交瘤细胞的筛选和鉴定26-29
• 2.1.4 单克隆抗体的纯化及鉴定29-33
• 2.2 ANKIB1的内源性表达和定位33-37
• 2.2.1 ANKIB1在人类不同细胞系的表达33-34
• 2.2.2 ANKIB1在HEK293细胞中的分布34-37
• 2.3 ANKIB1相互作用蛋白的筛选37-40
• 2.3.1 pull down筛选ANKIB1相互作用蛋白37
• 2.3.2 Co-IP筛选ANKIB1相互作用蛋白37-40
• 3 讨论40-43
• 4 结论43-45
• 参考文献45-49
• 综述49-61
• 参考文献57-61
• 附图161-62
• 攻读学位期间发表文章情况62-63
• 致谢63-64
• 个人简历64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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本文编号：960914