人细小病毒B19非结构蛋白NS1核输出机制研究

发布时间：2017-10-02 23:51

  本文关键词：人细小病毒B19非结构蛋白NS1核输出机制研究

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【摘要】：人细小病毒B19(B19)在1974年首次被发现,是细小病毒科(Parvoviridae)中已知的两种感染人的病毒之一。B19病毒在人群中分布广泛,感染后的临床症状随宿主的免疫系统和血液状况的不同而不同,它主要引起儿童的传染性红斑和成年人的急性对称关节炎,也能引发胎儿死亡、胎儿水肿、胎儿先天性贫血。目前主要的检测手段是特异性抗体及病毒DNA检测,免疫球蛋白能有效缓解病情。 B19病毒是无囊膜的单链DNA病毒,基因组全长5.4kb,两端有发卡结构。非结构蛋白NS1的编码序列全长2013bp(nt435-2448),共编码671个氨基酸,分子量为74kDa。研究报道,NS1能直接与病毒p6启动子结合并反式激活p6启动子调控病毒DNA的复制,NS1也能反式激活一些细胞启动子从而调控肿瘤坏死因子(TNF)-a和白介素(IL)-6的表达。与此同时,NS1能引起细胞周期阻滞,让细胞停留在G1期和S期,还能引起红血细胞的凋亡。种种迹象均表明,NSl既能进入细胞核与DNA结合并调控其启动子的活性,也能在细胞质中与相关的蛋白结合从而调控细胞因子和凋亡相关蛋白的表达。前期有研究表明,NS1在敏感细胞系主要定位在细胞核,少量分布在细胞质；另有研究称,NS1在非敏感细胞系中全部定位在细胞质；而相关文献也证实NS1是一种核质穿梭蛋白。但关于NS1的核质穿梭机制研究甚少,因此本文将从以下几个方面对NS1的这种核质穿梭机制进行初步研究： (1)确定NS1的核质穿梭现象。用B19的感染性克隆pB19-4244转染HEK-293T细胞,24小时后用LMB处理转染后细胞,观察NS1定位是否发生改变。随后用NS1-pEFGP-N1的重组载体转染细胞并进行相似处理及结果分析。 (2)利用相关软件对NS1蛋白序列进行分析,预测可能存在的核输出信号(Nuclear Export Signal, NES)序列。根据软件预测结果设计系列截短方案,构建野生型NS1及系列截短突变的NS1与pEGFP-N1的重组载体。将重组克隆转染HEK-293T细胞,荧光显微镜下观察实验结果,分析数据,初步确定NES在NS1上的分布情况。 (3)将初步确定的NES信号序列单独与EGFP融合,转染293T细胞,荧光显微镜下观察实验结果,分析数据,进一步确定NES是否都有活性。对有活性的NES进行关键位点的点突变,并同时在NS1全长上将对应氨基酸位点进行突变,观察突变是否改变蛋白定位。 (4)用LMB处理转染后细胞,确定NES序列是CRM1依赖型还是CRM1非依赖型,然后用哺乳动物双杂交系统检测NS1与CRM1的相互作用。 通过对pB19-4244转染293T后的细胞进行LMB处理,观察到NS1从细胞质中转移到了细胞核中,NS1-pEGFP-N1转染的细胞进行相同处理得到类似结果,从而确定NS1是可以进行核质穿梭并且NS1的出核是依赖于CRM1的。其后,通过系列截短突变及关键氨基酸位点的点突变,确定两个新的有生物活性的NES信号,即NES1与NES2,并且LMB处理实验初步证明NES2为CRM1依赖型而NES1为CRM1非依赖型,同时NS1上还存在其他的NES信号序列。最后,通过哺乳动物双杂交系统,我们检测到NS1与CRM1的直接相互作用,进一步说明NS1的这种出核转运是依赖于CRM1的。本研究初步阐明了NS1的核质穿梭机制,为NS1的功能研究提供一定的理论基础及依据。
【关键词】：细小病毒B19 NS1 NES CRM1
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 第一章 前言12-26
• 1.1 人细小病毒B1912-16
• 1.1.1 人细小病毒B19的发现及历史12
• 1.1.2 人细小病毒B19的分类学、形态学及基因组学研究12-14
• 1.1.3 人细小病毒B19的病原学及病理学研究14-15
• 1.1.4 人细小病毒B19的临床表征15-16
• 1.1.5 人细小病毒B19的诊断及治疗16
• 1.2 细胞内蛋白质的核质穿梭机制研究16-20
• 1.2.1 蛋白质的入核转运18-19
• 1.2.2 蛋白质的出核转运19-20
• 1.3 人细小病毒B19非结构蛋白NS1的核质穿梭机制研究20-22
• 1.3.1 人细小病毒B19非结构蛋白NS1的结构及基本性质20-21
• 1.3.2 细小病毒非结构蛋白的核质穿梭机制研究21
• 1.3.3 人细小病毒B19 NS1的核质穿梭机制研究21-22
• 1.4 哺乳动物双杂交系统22-24
• 1.4.1 哺乳动物双杂交系统简介22-24
• 1.4.2 哺乳动物双杂交系统在本实验中的具体应用24
• 1.5 本研究目的和意义24-26
• 第二章 实验材料及方法26-35
• 2.1 实验材料26-27
• 2.1.1 菌株及其培养基26
• 2.1.2 质粒及其提取试剂26-27
• 2.1.3 细胞系及其培养基27
• 2.1.4 其他27
• 2.2 实验方法27-35
• 2.2.1 引物设计29-30
• 2.2.2 重组载体的构建30-32
• 2.2.3 高纯质粒的提取32-33
• 2.2.4 细胞培养及质粒转染33
• 2.2.5 LMB处理33-34
• 2.2.6 制片及共聚焦显微镜观察34
• 2.2.7 哺乳动物双杂交系统的具体实验方案34-35
• 第三章 实验结果及分析35-49
• 3.1 NS1的亚细胞定位35-37
• 3.1.1 免疫荧光检测NS1的细胞内定位35
• 3.1.2 NS1-EGFP融合蛋白的细胞内定位35-36
• 3.1.3 NS1与其他细胞器的共定位研究36-37
• 3.2 NS1的核输出过程依赖于CRM137-39
• 3.2.1 免疫荧光检测NS1的定位改变37-38
• 3.2.2 NS1-EGFP融合蛋白的定位改变38-39
• 3.3 NS1核输出信号(NES)的初步确定39-43
• 3.3.1 不含NLS/NES的NS1截短突变蛋白的定位39-40
• 3.3.2 含三个NES的NS1截短突变蛋白的定位40
• 3.3.3 含两个NES的NS1截短突变蛋白的定位40-41
• 3.3.4 含一个NES的NS1截短突变蛋白的定位41-42
• 3.3.5 NES介导EGFP的出核转运42-43
• 3.4 依赖于CRM1的核输出信号(NES)的确定43-44
• 3.4.1 NS1截短突变蛋白的定位改变43-44
• 3.4.2 NS1-NES-EGFP融合蛋白的定位改变44
• 3.5 NES关键氨基酸位点的确定44-47
• 3.5.1 NS1-NES关键氨基酸位点的突变44-46
• 3.5.2 NS1全长上NES关键氨基酸位点的突变46-47
• 3.6 哺乳动物双杂交系统检测NS1与CRM1的直接相互作用47-49
• 第四章 讨论及展望49-52
• 4.1 讨论49-50
• 4.2 展望50-52
• 参考文献52-57
• 附录57-58
• 致谢58

【共引文献】

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本文编号：961908