b型流感嗜血杆菌多糖制备工艺及其D蛋白原核可溶性表达研究

发布时间：2017-10-03 23:29

  本文关键词：b型流感嗜血杆菌多糖制备工艺及其D蛋白原核可溶性表达研究

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【摘要】：流感嗜血杆菌可引起人类多种传染性疾病,最常见和最严重的是脑膜炎,其次是肺炎。根据主要的毒力因子一荚膜的有无,可将其分为两大类有荚膜型和无荚膜型。前者有a、b、c、d、e、f六个荚膜型别,其中b型最为流行,主要感染对象为儿童,几乎所有由hi(Haemophilus influenzae Hi)引起的脑膜炎病例和大多数其它菌血性病例均是感染b型菌所致。Hib是全球性的公共卫生问题,其发病率高、死亡率高的特点,促使科学工作者不断研究如何用疫苗来预防Hib感染。自上世纪80年代Hib疫苗问世以来,目前全球已有九十多个国家使用这一疫苗。在儿童免疫规划中常规接种疫苗的国家和地区,Hib疾病发病率迅速下降甚至消失。近年来人们发现Hib对氨苄青霉素和其它一些抗生素的耐药率增高,通过疫苗预防Hib疾病变得比以往更要。 第一部分是b型流感嗜血杆菌多糖制备工艺的研究。 首先制备了b型流感嗜血杆菌CMCC58534株的种子批,并进行了检定,然后对其进行扩大培养与发酵,之后通过甲醛杀菌、沉淀复合糖、去除核酸、沉淀粗糖、苯酚抽提去除蛋白、超滤去除苯酚、沉淀精糖等步骤对其荚膜多糖进行纯化。通过几批发酵培养与纯化,对其生产工艺进行了探讨与优化,最后确定发酵、纯化条件,在此条件下进行了连续三批100L发酵中试,得到的精糖产量均高于80mmg/L,且精糖鉴别试验、化学检定、细菌内毒素检查均合格,核磁共振检测证明其结构正常。说明生产工艺稳定,能够得到合格的Hib多糖。 第二部分是流感嗜血杆菌D蛋白基因工程可溶性表达。 流感嗜血杆菌蛋白D (Protein D, PD)是高度保守的表面脂蛋白,相对分子质量约42000,存在于所有可分型Hi和不可分型Hi(NTHi),是一种具有甘油磷酸二酯酶活性的细菌毒力因子,能导致宿主上皮细胞释放磷酸胆碱,在Hi引起呼吸道感染过程中起重要作用。流感嗜血杆菌D蛋白作为疫苗载体已应用于十价的肺炎结合苗中,在国外上市,安全性和免疫性均较好。本研究将Hib基因组DNA中去除信号肽的hpd基因片段插入pET43.1a表达质粒,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3), IPTG诱导表达。表达的重组蛋白,经过硫酸铵沉淀和DEAE sepharose Fast Flow阴离子交换层析纯化后,通过Western blot的方法证明得到了具有良好免疫反应原性的D蛋白。表达的蛋白以可溶性蛋白形式表达,表达量约占菌株总蛋白的44%。
【关键词】：b型流感嗜血杆菌 多糖 D蛋白 可溶性表达
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.41;Q78
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-8
• 前言8-11
• 1. Hib概况8-9
• 1.1 Hib病原学及流行病学8
• 1.2 Hib多糖免疫机理8-9
• 2. Hib结合疫苗9-11
• 2.1 结合方法9
• 2.2 结合用载体蛋白9-10
• 2.3 中国Hib疫苗应用现状10-11
• 3 本实验的目的及意义11
• 第一部分 b型流感嗜血杆菌的多糖的制备11-33
• 1. 材料11-13
• 1.1 菌株来源11
• 1.2 主要试剂11-12
• 1.3 主要仪器设备12-13
• 1.4 主要试剂配方13
• 2. 方法13-23
• 2.1 种子批制备及检定13-15
• 2.2 Hib菌种的发酵培养15
• 2.3 多糖制备工艺15-17
• 2.4 连续三批100L发酵中试生产多糖的质量鉴定17-23
• 3. 结果23-32
• 3.1 种子批检定结果23-24
• 3.2 菌种扩大培养过程中各项鉴定24-26
• 3.3 多糖制备工艺的优化26-28
• 3.4 连续三批100L发酵中试生产多糖的质量鉴定28-32
• 4. 讨论32
• 5. 小结32-33
• 第二部分 b型流感嗜血杆菌D蛋白原核可溶性表达33-48
• 1. 实验材料33
• 1.1 菌株及质粒33
• 1.2 试剂33
• 1.3 主要器材与仪器33
• 1.4 主要试剂配方33
• 2. 方法33-40
• 2.1 HibCMCC58534株基因组的制备33-34
• 2.2 b型流感嗜血杆菌D蛋白(hpd)基因的扩增34-35
• 2.3 重组表达载体的构建及克隆35-38
• 2.4 D蛋白的原核表达38-39
• 2.5 重组D蛋白的纯化39
• 2.6 重组D蛋白Western blot分析39-40
• 3. 结果40-45
• 3.1 b型流感嗜血杆菌D蛋白(hpd)基因的扩增40
• 3.2 重组表达质粒的鉴定40-43
• 3.3 表达产物的SDS-PAGE分析43-44
• 3.4 D蛋白纯化过程中SDS-PAGE分析44-45
• 3.5 重组D蛋白的Western blot分析45
• 4. 讨论45-47
• 4.1 目的蛋白的分析与表达45
• 4.2 表达系统与表达载体的选择45-46
• 4.3 重组D蛋白的表达46
• 4.4 重组D蛋白的纯化46
• 4.5 本研究的意义46-47
• 5. 小结47-48
• 参考文献48-52
• 附录1 缩略语52-53
• 附录2 溶液配制53-60
• 致谢60-61
• 个人简历61-62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：967370