大竹蛏肽聚糖识别蛋白的免疫防御功能研究

发布时间：2017-10-05 12:17

  本文关键词：大竹蛏肽聚糖识别蛋白的免疫防御功能研究

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【摘要】：大竹蛏（Solen grandis）属瓣鳃纲，广泛分布于中国沿海各地。因其个体大、出肉率高、味道鲜美、营养丰富和经济价值高，大竹蛏已成为我国重要的海洋经济品种之一。与其它海洋无脊椎动物相似，大竹蛏缺乏获得性免疫系统，主要依靠先天性免疫系统抵御外界病原微生物的侵害。 肽聚糖识别蛋白是无脊椎动物先天性免疫中重要的模式识别受体，能够识别细菌的肽聚糖，，在病原识别和清除过程中发挥重要作用。到目前为止，对大竹蛏肽聚糖识别蛋白的研究非常有限，其抵御外来病原入侵的作用机制尚不清楚。本研究结合分子生物学和免疫生物学的实验方法和技术，对大竹蛏肽聚糖识别蛋白介导的免疫识别和免疫应答进行研究，旨在深入了解大竹蛏的先天性免疫机制。 (一)序列分析 本研究获得了大竹蛏肽聚糖识别蛋白SgPGRP-S1和SgPGRP-S2编码基因的cDNA，其全长分别为1672和1285bp，各自编码270和141个氨基酸。ExPASy预测两个蛋白基因的理论等电点分别为7.82和5.46，分子量分别为28.4和14.7kDa。 同源性分析显示SgPGRP-S1与SgPGRP-S2之间的相似度为51%，二者分别与光滑双脐螺（ABO40829）和囊舌虫（XP_002734591）的肽聚糖识别蛋白同源性最高，相似度分别为57%和55%。 多序列比对发现，SgPGRP-S1和SgPGRP-S2序列中均存在高度保守的Zn2+结合位点和酰胺酶催化位点，Zn2+结合位点分别为H135、H244和C252以及H115和C123，酰胺酶催化位点分别为H135，Y170，H244，T250和C252以及H115、T121和C123。 构建系统进化树探讨SgPGRP-S1和SgPGRP-S2与其它生物（牡蛎、栉孔扇贝、海湾扇贝、果蝇和人）的进化关系，发现SgPGRP-S1和SgPGRP-S2与软体动物具有较高的同源性，与牡蛎的四种肽聚糖识别蛋白-S1S、-S1L、-S2，-S3聚合成支。 以上结果证明SgPGRP-S1和SgPGRP-S2是肽聚糖识别蛋白超家族的重要成员。 (二)荧光定量PCR检测SgPGRP的转录规律 利用荧光定量PCR法检测了SgPGRP-S1和SgPGRP-S2在健康大竹蛏组织中的转录规律，发现二者在所有检测组织中都有表达。SgPGRP-S1在肌肉和肝胰腺中的表达量最高，其次为鳃、外套膜、性腺，在血细胞中的表达量最低；SgPGRP-S2在鳃和外套膜中表达量较高，其次为血细胞和性腺，在肌肉中表达量最低。 此外，通过荧光定量PCR分析检测LPS、PGN和glucan刺激后SgPGRP-S1在血细胞中的表达规律。经PGN刺激后，SgPGRP-S1的表达量在3h显著升高为对照的14.3倍；在6h达到最高，为对照组的7471倍；在12h和48h分别降低为对照组的13.9和5.7倍。经glucan刺激后，SgPGRP-S1的表达量在12、24和48h分别显著升高为对照组的22.4、11.9和89.7倍。而在LPS刺激后，SgPGRP-S1的表达量较对照组没有显著升高。 与SgPGRP-S1相比，SgPGRP-S2的表达量在LPS刺激后升高显著，在6h升高为对照组的4.1倍，在24h和48h又显著下调为0.1和0.3倍。经PGN刺激后，SgPGRP-S2的表达趋势与SgPGRP-S1相似，在6h达到高，在12h略降低后，24h升高为对照的4.4倍。在glucan刺激组，SgPGRP-S2的表达量在12h显著升高为对照组的23.1倍，随后恢复到原始水平。 (三) rSgPGRP-S1活性分析 PAMPs结合实验表明，SgPGRP-S1重组蛋白（rSgPGRP-S1）可以体外结合PGN，其结合能力随其浓度增大而增强。rSgPGRP-S1对LPS和β-glucan均无结合能力。这些结果表明SgPGRP-S1主要介导大竹蛏对PGN的免疫识别作用。 rSgPGRP-S1具有广谱凝菌活性，对大肠杆菌和鳗弧菌等革兰氏阴性菌以及藤黄微球菌等革兰氏阳性菌有凝集活性。该结果初步揭示了SgPGRP-S1作为模式识别受体，参与大竹蛏对抵御入侵病原微生物的免疫识别和免疫应答反应。 进一步研究rSgPGRP-S1的酰胺酶活性，发现其具有依赖Zn2+的酰胺酶活性，通过水解N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之间的肽键而降解不溶性PGN。使用平板扩散法检测rSgPGRP-S1对革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的抑制活性，发现存在Zn2+时，rSgPGRP-S1对两种细菌均具有显著的抑制活性，产生明显的抑菌圈。 同时检测rSgPGRP-S1对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长曲线的影响，发现Zn2+存在时，rSgPGRP-S1在细菌生长对数期能够明显抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，而在生长稳定期表现出显著的杀菌活性。rSgPGRP-S1的这种抑菌杀菌活性可能与其酰胺酶活性有关。 综上所述，本论文研究了大竹蛏肽聚糖识别蛋白作为模式识别受体，介导对PAMPs和病原微生物等的免疫识别作用和抵御病原微生物入侵等免疫应答反应的作用机制。研究结果为进一步探讨软体动物等无脊椎动物的免疫应答机制提供了理论依据，同时丰富和发展了海洋无脊椎动物免疫防御机制的理论研究。
【关键词】：大竹蛏 先天性免疫 肽聚糖识别蛋白 免疫识别 免疫应答
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-17
• 引言17-32
• 1 无脊椎动物的先天性免疫系统17-24
• 1.1 非己的识别18-20
• 1.2 免疫信号的调整和放大20-21
• 1.3 病原体的清除21-24
• 2 肽聚糖识别蛋白概述24-28
• 2.1 肽聚糖识别蛋白的发现24-25
• 2.2 肽聚糖识别蛋白的结构和分类25-26
• 2.3 肽聚糖识别蛋白的功能26-28
• 3 软体动物肽聚糖识别蛋白的研究进展28-30
• 4 本研究的目的和意义30-32
• 第一章 SgPGRP-S1 和 SgPGRP-S2 序列全长合成及序列分析32-41
• 1 材料与方法32-34
• 1.1 试验样品32
• 1.2 实验仪器32
• 1.3 主要试剂32
• 1.4 实验方法32-34
• 2 实验结果34-39
• 2.1 SgPGRP-S1 和 SgPGRP-S2 的 cDNA 全长及氨基酸序列特征34-35
• 2.2 SgPGRP-S1 和 SgPGRP-S2 的多序列比对35-36
• 2.3 SgPGRP-S1 和 SgPGRP-S2 的系统进化分析36-38
• 2.4 SgPGRP-S1 三级结构预测38-39
• 3 讨论39-40
• 4 小结40-41
• 第二章 荧光定量 PCR 分析 SgPGRP-S1 和 SgPGRP-S1 的表达规律41-48
• 1 材料与方法41-44
• 1.1 试验样品41
• 1.2 实验仪器41
• 1.3 主要试剂41
• 1.4 实验方法41-44
• 2 实验结果44-46
• 2.1 SgPGRP-S1 和 SgPGRP-S2 在健康大竹蛏组织中的表达规律44
• 2.2 SgPGRP-S1 和 SgPGRP-S2 在微生物多糖刺激后的表达规律44-46
• 3 讨论46
• 4 小结46-48
• 第三章 SgPGRP-S1 重组质粒的构建及活性分析48-68
• 1 材料与方法48-59
• 1.1 试验样品48
• 1.2 实验仪器48
• 1.3 主要试剂48-49
• 1.4 实验方法49-59
• 2 实验结果59-64
• 2.1 rSgPGRP-S1 蛋白的制备59-60
• 2.2 rSgPGRP-S1 多克隆抗体的制备60
• 2.3 rSgPGRP-S1 的 PAMPs 结合活性60-61
• 2.4 rSgPGRP-S1 的抑菌活性61-63
• 2.5 rSgPGRP-S1 的凝菌活性63-64
• 2.6 rSgPGRP-S1 的酰胺酶活性64
• 3 讨论64-66
• 4 小结66-68
• 结论68-71
• 参考文献71-77
• 附录77-81
• 已完成文章81-83
• 致谢83

【共引文献】

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本文编号：976751