骨髓间充质干细胞移植对大鼠重症急性胰腺炎肺组织E-选择素表达的影响和意义

发布时间：2017-10-06 08:00

  本文关键词：骨髓间充质干细胞移植对大鼠重症急性胰腺炎肺组织E-选择素表达的影响和意义

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【摘要】：重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是病情复杂险重、并发症累及广泛、病死率较高的难治性疾病。急性期易诱发急性肺损伤(acute lung injury，ALI)，引起毛细血管膜弥散性破坏，出现肺水肿和肺不张，病情发展导致急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，目前临床治疗仍缺乏特异性和有效性。因此，ALI是SAP最常见、最严重全身并发症之一。肺富含大量毛细血管，血流丰富，SAP时过度释放入血的炎症介质易导致肺成为炎性损伤最严重、最主要的靶器官之一。其中肺血管内皮细胞(pulmonary vascular endothelial cells，PVEC)又是肺损伤时受累的重要靶细胞，病理状态下，PVEC上异常表达的物质能促进血管内循环的白细胞与其发生相互作用，进而使白细胞附壁，破坏PVEC，并向血管外迁移，这是导致肺损伤的重要环节。E-选择素(E-selectin，Es)参与介导此过程，PVEC活性增加时，其Es表达增高，而PVEC活性增加是血管病变的重要阶段。因此，PVEC上Es的高表达有助于提示肺血管病变早期内皮细胞活化程度，是内皮细胞进一步损伤的征兆。最近研究报道，成体组织来源的骨髓间充质干细胞(Bone marrowMesenchymal Stem Cells，BMSCs)对ALI具有免疫调节、修复微环境或替代损伤的肺组织细胞等生物学功能。本课题以大鼠SAP模型为研究对象，观察肺组织Es动态变化特点。经静脉移植同种异体BMSCs，观察其在损伤肺组织的分布定植，探讨BMSCs移植对SAP大鼠肺组织Es表达及部分细胞因子水平的影响和意义。 【目的】 1.建立可靠、简便、重复性好，具有显著ALI表现的SAP动物模型，了解大鼠SAP模型病程规律及病理改变，为下步实验研究提供良好的动物模型基础。 2.分析逆行胆胰管注射法制作的大鼠SAP模型诱发肺损伤严重程度，并探讨该模型下肺组织Es变化规律，为下步SAP肺损伤的干预研究提供依据。 3.建立体外分离、纯化、快速扩增SD大鼠BMSCs的科学方法，以获得足够BMSCs，并分析部分表型特征。为下步运用BMSCs移植治疗SAP肺损伤模型的研究提供实验基础材料。 4.通过BMSCs移植干预大鼠SAP模型诱发的肺损伤，检测肺组织Es含量、炎症介质TNF-α、IL-1β水平等。探讨BMSCs能否可通过抑制肺组织Es表达及炎症介质释放，对SAP肺损伤发挥保护作用。 【方法】 1.经胆胰管逆行注射5%脱氧牛磺胆酸钠建立SAP模型：清洁级雄性SD大鼠，随机分成实验组(SAP)和假手术组(SO)。10%水合氯醛腹腔麻醉，暴露胰腺，辨认胆胰管，夹闭靠近肝门段的胆胰管，经胆胰管逆行注射5%脱氧牛磺胆酸钠，缝扎胆胰管远端；SO组仅翻动按摩胰腺。术后补液支持。观察2组大鼠48h生存质量，于3h、6h、12h、24h分批处死大鼠，分析血清淀粉酶、白蛋白、Ca~(2+)水平及胰腺病理改变。评价该模型严重程度和制作方式的可行性。 2.清洁级雄性SD大鼠随机分成实验组(SAP)、假手术组(SO)，胆胰管逆行注射5%脱氧牛磺胆酸钠制作大鼠SAP模型。观察3h，6h，12h，24h两组动物肺湿/干重比，肺组织病理改变；实时荧光定量PCR及免疫组织化学法观察肺组织Es变化。 3.全骨髓差异贴壁法培养获取BMSCs：无菌条件下，分离幼龄SD大鼠双侧胫股骨。DMEM/F12缓慢冲洗骨髓腔，离心骨髓细胞悬液，用1%青链霉素-10%FBS的DMEM/F12吹打重悬，以2×10~5/m1接种于25cm~2细胞培养瓶。静置于37°C，饱和湿度，5%CO_2培养箱内培养。观察细胞形态和生长情况，并按1:2或1:3传代扩增。收获生长良好的第3代细胞，流式细胞仪检测CD29~+CD90~+CD34~-CD45~-细胞群，分析BMSCs纯度。 4.逆行胆胰管注射5%脱氧牛磺胆酸钠制作大鼠SAP模型，随机取4只用于BMSCs示踪观察，其余随机分成对照组(Control-SAP)、BMSCs治疗组(BMSCs-SAP)和MP治疗组(MP-SAP)。P3代BMSCs制成1×10~6/ml细胞悬液，建模后1h经尾静脉按1ml细胞悬液/100g体重输注大鼠体内(干细胞示踪大鼠输入CM-DiI标记的BMSCs)；对照组和MP治疗组分别注射等体积量生理盐水和MP。观察3h、6h、12h、24h各组大鼠血清淀粉酶、白蛋白、TNF-α、IL-1β水平，肺湿/干重比；肺与胰腺组织病理改变；实时荧光定量PCR及免疫组织化学法分析肺组织Es表达变化。BMSCs示踪大鼠取肺组织快速冰冻，荧光显微镜下观察CM-DiI阳性细胞(BMSCs)分布。 【结果】 1. SAP组大鼠表现为弓背、蜷曲、竖毛、不喜动、呼吸困难等。腹腔血性腹水，胰腺胶冻样坏死及皂化斑；病理显示胰腺组织间隙增大，炎症细胞浸润，微血管破裂出血，腺泡细胞坏死，腺体结构破坏等。与SO组同期相比，SAP组大鼠胰腺病理学评分、血清淀粉酶明显升高；白蛋白、Ca~(2+)水平降低(p0.05)，大鼠生存率下降。 2.与SO组大鼠相比，SAP组大鼠出现进行性加重的呼吸衰竭表现，病理显示肺泡间隔增宽、炎症细胞浸润，肺泡腔内渗液、出血，肺泡萎陷不张、部分实变等；肺湿/干重比及病理学评分增高。实时荧光定量PCR分析，SAP组大鼠肺组织EsmRNA在3h即明显增加，6h达高峰；免疫荧光组织化学显示，Es蛋白分布于肺血管内皮细胞胞膜及胞浆中，表达程度较Es mRNA变化延迟，但趋势较为相符。 3.培养的原代细胞24h后可见绝大多数已贴壁，呈多角形、纺锤样等混合形态，至7~8d细胞汇合达90％，部分聚集形成集落。定期换液和传代，细胞纯化。第3代细胞形态均一，多呈稍宽的长梭形，类似成纤维样，“漩涡状”排列增多。流式细胞仪结果显示：CD29~+CD90~+CD34~-CD45~-细胞群占91.3%以上。免疫表型符合BMSCs表面抗原特征，为SAP模型肺组织Es干预研究提供细胞来源。 4.经BMSCs移植的SAP大鼠精神好转，呼吸较平稳，口鼻无粉红色泡沫出现，48h生存率显著提高。荧光显微镜下，肺组织CM-DiI阳性细胞(BMSCs)分布呈时序性增加。与Control-SAP组相比，肺组织Es mRNA、Es蛋白表达及肺湿/干重比降低，胰腺和肺病理损害减轻；血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β等水平显著降低，白蛋白升高。但BMSCs治疗效果几乎均显著差于MP治疗组(p0.05)。 【结论】 1.采用经胆胰管逆行注射5%脱氧牛磺胆酸钠的方法建立SAP模型，可以引起胰腺严重的病理损害，出现SAP呼吸系统并发症等相应临床表现。模型制作方法可靠易行，成功率高，适合作为研究对象。 2. SAP早期诱发不可逆的肺病理损伤及相应肺功能损害表现。SAP肺损伤时导致肺血管内皮细胞上E-选择素表达增加极早出现，肺血管内皮细胞上Es表达变化陡增后缓慢下降。Es介导白细胞在血管内壁的滚动、附壁及迁移外渗过程。Es的增高早期反映了肺血管内皮细胞活化和内皮屏障功能失衡。 3.经全骨髓差异贴壁法获取纯度较高的BMSCs，流式细胞仪鉴定符合BMSCs细胞表面抗原特征，P3代BMSCs含量达到91.3%以上。说明此法简单、适用、高效，为后续实验提供了充足的BMSCs来源。 4.同种异体BMSCs可迁移至SAP大鼠受损的肺组织，发挥保护与修复作用。BMSCs调节大鼠SAP时全身炎症反应，抑制炎症介质过度释放，减轻肺免疫损伤；同时，降低肺血管内皮细胞活性，减少Es表达，阻止Es介导下白细胞与肺血管内皮细胞的粘附及外渗，保护内皮细胞，促进肺血管内皮屏障功能修复，有效阻止肺毛细血管内物质渗漏，改善肺功能。甲氢泼尼松琥珀酸钠在SAP早期应急疗效明显，，但BMSCs丰富的生物学功能使其在SAP后期组织修复中优势更为明显。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 异体移植 模型 胰腺炎 肺损伤 内皮细胞 E-选择素 细胞因子
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R657.51;R-332
【目录】：

• 中文摘要5-9
• Abstract9-14
• 缩略词表14-16
• 前言16-20
• 参考文献17-20
• 第一部分 重症急性胰腺炎动物模型的建立20-33
• 一、材料和方法20-24
• 二、结果24-28
• 三 讨论28-31
• 参考文献31-33
• 第二部分 重症急性胰腺炎动物模型肺损伤及肺组织 E-选择素变化特点评估33-50
• 一、材料和方法33-37
• 二、结果37-45
• 三 讨论45-48
• 参考文献48-50
• 第三部分 骨髓间充质干细胞的体外分离培养及鉴定50-63
• 一、材料和方法50-53
• 二、结果53-57
• 三、讨论57-60
• 参考文献60-63
• 第四部分 同种异体骨髓间充质干细胞移植对重症急性胰腺炎肺组织 E-选择素的干预作用63-92
• 一、材料和方法63-69
• 二、结果69-82
• 三、讨论82-86
• 参考文献86-92
• 全文结论92-93
• 综述 骨髓间充质干细胞对急性胰腺炎与肺损伤作用机制的研究93-101
• 参考文献98-101
• 发表论文101-102
• 致谢102

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：981603