B群脑膜炎球菌重组LTB-NspA融合蛋白疫苗免疫活性及保护作用的初步研究

发布时间：2017-10-07 00:17

  本文关键词：B群脑膜炎球菌重组LTB-NspA融合蛋白疫苗免疫活性及保护作用的初步研究

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【摘要】：目的：构建LTB-NspA重组蛋白疫苗，经腹腔注射途径免疫BALB/c雌性小鼠，探讨黏膜免疫佐剂LTB是否能够增强疫苗抗原NspA的体液免疫（尤其是黏膜免疫）及细胞免疫应答水平，初步评价LTB-NspA重组蛋白疫苗对小鼠的免疫保护作用，为研制有效抗B群脑膜炎奈瑟菌的蛋白疫苗提供相关实验依据。 方法：分别以大肠杆菌标准菌株H44815基因组和B群脑膜炎奈瑟菌标准株MC58基因组为模板，运用PCR及重叠延伸PCR技术，构建原核重组表达载体pET-30a/ltb、pET-30a/nspa和pET-30a/ltb-nspa，大量表达重组蛋白，经His亲和层析纯化柱咪唑浓度梯度洗脱，收集重组蛋白，蛋白印迹法（Western blot）鉴定其抗原性；腹腔注射途径免疫BALB/c雌性小鼠，酶联免疫吸附法（ELISA）检测蛋白疫苗免疫后的小鼠血清中抗NspA的IgG及其亚类抗体水平、小鼠生殖道黏膜分泌液中抗NspA的SIgA抗体水平及小鼠脾淋巴细胞培养上清液中IL-4、IFN-γ水平，CCK8法检测小鼠的脾淋巴细胞增殖反应；计算LTB-NspA重组蛋白疫苗对BALB/c雌性小鼠的免疫保护率。 结果：经双酶切和测序鉴定，成功构建了三个原核表达载体：pET-30a/ltb、pET-30a/nspa和pET-30a/ltb-nspa；分别优化重组蛋白的诱导表达条件后，重组蛋白均能在上清中以可溶性状态表达，表达产物采用His树脂纯化后经Western-blot鉴定，证实目的蛋白的存在；腹腔注射途径免疫BALB/c雌性小鼠，LTB-NspA组血清特异性IgG及IgG1、IgG2a、IgG3和生殖道黏膜产生的特异性SIgA随免疫时间均呈上升趋势，IgG2b在第4周达峰值：LTB-NspA组IgG、IgG2a水平明显高于NspA组(P0.05)；LTB-NspA组IgG1水平在6w时明显高于NspA组(P0.05)；LTB-NspA组IgG2b水平2w、4w时明显高于NspA组(P0.05)；LTB-NspA组IgG3、SIgA水平在4w、6w时明显高于NspA组(P0.05)；而对照组PBS组和LTB组间抗体水平无显著性差异(P0.05)。 LTB-NspA组IgG2a/IgG1的比值，在免疫的2w、4w、6w时分别为0.808、0.840和0.943，比值均小于1；LTB-NspA组IL-4含量（204.778±18.936）pg/mL明显高于NspA组(146.896±13.281) pg/mL (P0.05)，，LTB-NspA组IFN-γ含量（129.210±18.621）pg/mL明显高于NspA组(65.428±14.326) pg/mL (P0.05)； LTB-NspA组和NspA组的脾淋巴细胞刺激指数（SI）明显高于PBS组和LTB组（P0.05），两蛋白组间SI无明显差异(P0.05)；LTB-NspA组小鼠免疫血清补体介导的体外杀菌效价（6w）达1：64；小鼠感染MC58后72h，LTB-NspA组小鼠的存活率（90%）高于NspA组小鼠的存活率（70%），而PBS组和LTB组的存活率为0。 结论：1.LTB-NspA蛋白疫苗能够诱生较高水平的特异性体液免疫和细胞免疫，且以Th2倾向性体液免疫应答为主；黏膜免疫佐剂LTB可有效提高NspA基因诱导的特异性黏膜免疫应答水平及血清IgG抗体水平；2.LTB-NspA蛋白疫苗对感染B群脑膜炎奈瑟菌的BALB/c小鼠具有良好的免疫保护效果。
【关键词】：B群脑膜炎奈瑟菌 奈瑟菌表面蛋白A 大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 蛋白疫苗 免疫活性 免疫保护
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378
【目录】：

• 英文缩略语索引4-6
• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 前言10-12
• 实验材料12-14
• 实验方法14-30
• 实验结果30-44
• 讨论44-46
• 结论46-47
• 参考文献47-51
• 附录51-54
• 文献综述54-61
• 参考文献58-61
• 发表及待发表论文61-62
• 致谢62

【参考文献】

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1 郑继平,刘向昕,王令春,李淑琴,方门忠,张兆山;产肠毒素大肠杆菌混合载体疫苗的免疫原性评价[J];现代免疫学;2004年06期

2 邵祝军;徐丽;高源;李马超;李艺星;尹遵栋;梁晓峰;;中国流行性脑脊髓膜炎流行菌群变化趋势分析[J];中国计划免疫;2007年06期

本文编号：985850