蓝氏贾第鞭毛虫三种基因功能研究载体的构建

发布时间：2017-10-07 00:06

  本文关键词：蓝氏贾第鞭毛虫三种基因功能研究载体的构建

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【摘要】：蓝氏贾第鞭毛虫(Giardialamblia，简称贾第虫)是一种单细胞寄生性原虫，可引起蓝氏贾第鞭毛虫病。贾第虫是生物进化过程中最早分化出来的真核生物之一，在生物进化中有着特殊的地位。随着贾第虫基因组测序的完成，贾第虫研究逐渐步入基因功能阶段。外源基因及重组基因的体内表达是研究基因功能的重要手段。目前分子生物学研究中常见的表达载体基本不能用于贾第虫基因功能研究。基于以上两个方面的要求，本研究拟构建一个带有HA标签的贾第虫基因快速标记载体和一个贾第虫稳定表达载体，并进一步构建带有SNAP/CLIP融合蛋白标签的表达载体。 本研究采用重叠PCR的方法将Neo基因置于gdh启动子调控下构建抗性基因表达框，并插入pGEM-5zf(+)载体，获得带有Neo筛选标记的重组载体pGLgdh-Neo；将基因合成所得3'末端带有3个HA标签的MCS区克隆至上述载体，构建了带有MCS区及3个HA标签的可快速标记蓝氏贾第鞭毛虫基因的重组载体pGLMCS-3HA-gdh-Neo，长度为4268bp。以贾第虫组蛋白H2A为标记基因验证所构建载体的有效性。对H2A贾第虫重组株进行基因组PCR、蛋白质印迹及免疫荧光分析。H2A重组质粒稳定转染至贾第虫滋养体并正确整合至其基因组，可表达HA标记的H2A。 以pGLgdh-Neo为基础，在gdh5'UTR端插入贾第虫tim基因以方便载体与基因组整合，得到pGLtim-gdh-Neo；设计并合成α2-Tubulin启动子驱动的含有16个酶切位点的MCS区的完整表达框，ApaⅠ单酶切插入pGLtim-gdh-Neo，构建了可稳定转染，，带有多克隆位点区及Neo抗性基因的重组表达载体pGLtim-Tub-MCS-gdh-Neo，其长度为5395bp。在MCS区插入Luc，对Luc重组株进行荧光素酶活性检测以验证重组载体有效性。Luc重组质粒pGLtim-Tub-Luc-gdh-Neo稳定转染至贾第虫，且Luc重组株荧光素酶在虫体中获得表达。 分别将SNAP/CLIP序列克隆至重组载体pGLtim-Tub-MCS-gdh-Neo的MCS区，构建分别含有SNAP/CLIP融合蛋白标签的表达载体。 本研究成功构建了贾第虫快速标记载体pGLMCS-3HA-gdh-Neo，稳定表达载体pGLtim-Tub-MCS-gdh-Neo及带有SNAP/CLIP融合蛋白标签的表达载体，可用于贾第虫基因的原位标记、蛋白的亚细胞定位、基因过表达或敲除、蛋白相互作用及活细胞中融合蛋白标记等方面的研究，为贾第虫基因功能的研究提供有力平台。
【关键词】：蓝氏贾第鞭毛虫 标记载体 表达载体 蛋白标签
【学位授予单位】：大连大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R382.2
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 引言12-14
• 1 实验一蓝氏贾第鞭毛虫基因快速标记载体的构建14-33
• 1.1 实验材料与试剂14-16
• 1.1.1 虫株与质粒14-15
• 1.1.2 试剂15
• 1.1.3 培养基15-16
• 1.2 实验仪器16
• 1.3 实验方法16-26
• 1.3.1 蓝氏贾第鞭毛虫基因组 DNA 的提取16-17
• 1.3.2 pGL gdh-Neo重组质粒构建17-22
• 1.3.3 贾第虫快速标记载体pGL MCS - 3HA -gah- Neo 的构建22-23
• 1.3.4 应用重组载体pGL MCS - 3HA -gdh- Neo 标记贾第虫 H2A 基因23-24
• 1.3.5 H 2A 重组质粒电穿孔转染及 G418 筛选24-25
• 1.3.6 H2A 贾第虫重组株基因组 PCR 鉴定25
• 1.3.7 H2A 贾第虫重组株蛋白质印迹分析25
• 1.3.8 H2A 贾第虫重组株免疫荧光分析25-26
• 1.4 实验结果与分析26-32
• 1.4.1 蓝氏贾第鞭毛虫基因组总 DNA 的提取26-27
• 1.4.2 gdh 基因侧翼序列和 Neo 基因编码序列的 PC R 扩增27-28
• 1.4.3 片段 gdh 5' UT R- N eo -gdh 3 ' U T R 的扩增28
• 1.4.4 pGL gdh- Neo 重组质粒 PCR 鉴定28-29
• 1.4.5 GlH2A 基因的扩增29
• 1.4.6 GlH2A 的标记载体pGL H2A -3HA- gdh -Neo 构建29-30
• 1.4.7 H2A 贾第虫重组株基因组 PC R 分析30
• 1.4.8 H2A 贾第虫重组株蛋白质印迹分析30-31
• 1.4.9 H2A 贾第虫重组株免疫荧光分析31-32
• 1.5 实验讨论32-33
• 2 实验二蓝氏贾第鞭毛虫稳定表达载体的构建33-44
• 2.1 实验材料和质粒33-34
• 2.1.1 质粒33-34
• 2.1.2 实验试剂34
• 2.2 实验仪器及设备34
• 2.3 实验方法34-39
• 2.3.1 pGL tim-gdh-Neo 重组质粒构建34-36
• 2.3.2 pGL tim-Tub-MCS-gdh-Neo 重组质粒构建36-37
• 2.3.3 pGL tim-Tub-Luc-gdh-Neo 重组质粒构建37-38
• 2.3.4 pGL tim-Tub-Luc-gdh-Neo 重组质粒电穿孔转染及 G418 筛选38-39
• 2.3.5 荧光素酶活性检测39
• 2.4 实验结果与分析39-42
• 2.4.1 tim 基因的 PCR 扩增39-40
• 2.4.2 pGL tim-gdh-Neo 重组质粒构建40
• 2.4.3 pGL tim-Tub-MCS-gdh-Neo 重组质粒构建40-41
• 2.4.4 Luc 的 PCR 扩增41
• 2.4.5 pGL tim-Tub-Luc-gdh-Neo 重组质粒构建41-42
• 2.4.6 荧光素酶活性检测42
• 2.5 实验讨论42-44
• 3 实验三 蓝氏贾第鞭毛虫带有 SN A P/ CLIP 融合蛋白标签的表达载体构建44-50
• 3.1 实验材料和质粒44-45
• 3.1.1 质粒44-45
• 3.1.2 实验试剂45
• 3.2 实验仪器及设备45
• 3.3 实验方法45-47
• 3.3.1 SNAP/CLIP 的 PC R 扩增45-46
• 3.3.2 SNAP/CLIP 标签重组质粒构建46-47
• 3.3.3 菌种冻存47
• 3.4 实验结果与分析47-49
• 3.4.1 SNAP/CLIP 的 PCR 扩增47
• 3.4.2 PCR法鉴定pGL tim-Tub- SNAP/CLIP- gdh- Neo 重组质粒47-48
• 3.4.3 双酶切法鉴定pGLtim -Tub- SNAP/ CLIP- gdh - Neo 重组质粒48-49
• 3.5 实验讨论49-50
• 结论50-51
• 参考文献51-52
• 论文综述52-59
• 参考文献57-59
• 附录A 缩写词59-60
• 附录B 主要溶液的配制60-65
• 附录C 相关载体说明65-80
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况80-81
• 致谢81

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 陈丽凤;李建华;刘全;赵月平;曹利利;张西臣;;犬贾第虫病毒转染载体介导的绿色荧光蛋白在犬贾第虫体内的表达[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2007年01期

2 巨红妹;王乙惠;张霞;王云华;李雅杰;;蓝氏贾第鞭毛虫基因快速标记载体的构建[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2012年03期

本文编号：985766