甲基苯丙胺对中脑—边缘投射多巴胺神经元电生理学特性的影响及机制研究

发布时间：2017-10-07 04:21

  本文关键词：甲基苯丙胺对中脑—边缘投射多巴胺神经元电生理学特性的影响及机制研究

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【摘要】：多年的神经解剖学研究表明,多巴胺神经元主要分布于哺乳动物中脑黑质致密部(substantia nigra, SN)和腹侧被盖区(ventral tegmental area, VTA),是脑内神经递质多巴胺的主要来源。这些多巴胺神经元在发育过程中,轴突投射至不同的脑区,分别与锥体外系运动、精神与情感以及药物成瘾有关。其中,VTA内向边缘系统投射的多巴胺神经元为中脑-边缘投射神经元,其投射靶区为伏隔核(nucleus accumbens, NAc)及杏仁体,伏隔核为主要投射靶区。中脑-边缘多巴胺神经元投射是药物成瘾的结构基础,并且是众多中枢神经兴奋剂的作用靶点。近年研究发现,中脑-边缘投射多巴胺神经元具有不同的电生理及分子特性,对不同成瘾药物的反应也不一致。因此,揭示这群多巴胺神经元特异的电生理学特性具有重要的意义。 甲基苯丙胺(methamphetamine, MA)是一种常用的中枢神经兴奋剂,具有严重的成瘾性。近年来研究发现,MA不仅可以抑制神经元兴奋性,还可通过DAT对多巴胺神经元产生兴奋作用。但MA对中脑-边缘投射多巴胺神经元电生理学特性的影响及其机制还不清楚。 超极化激活阳离子电流(hyperpolarization-activated cation current,Ih)是内向去极化电流,可增强神经元的放电频率和兴奋性。Ih电流直接调节神经元膜电位、自发动作电位产生、神经递质释放及突触重塑等生理活动,并与酒精成瘾、帕金森病、抑郁症有关。Ih电流受众多的细胞内物质的影响,如4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)、环磷酸腺苷(cAMP)、蛋白激酶C(PKc)等,也可以受到细胞外众多物质的调控。除中脑内向额叶皮层投射的多巴胺神经元外,大部分中脑多巴胺神经元具有Ih电流,在一定程度上是多巴胺神经元的电生理标志之一。研究发现,多巴胺可作用D2受体激活G蛋白抑制Ih电流。 MA主要作用于II型囊泡单胺转运体(vesicular monoamine transporters2, VMAT2)和多巴胺转运体(dopamine transporter, DAT)使细胞外多巴胺增加,作用于多巴胺神经元细胞体与树突上的D2受体,使神经元超极化,并作用于DAT产生一定兴奋作用。但是,MA是否影响中脑-边缘多巴胺神经元的Ih电流,以及其潜在的机制还不清楚。 为此,我们设计了以下实验来检测MA对中脑-边缘投射多巴胺神经元电生理的影响,及Ih电流的改变和可能的机制。 (1)将2周龄Wistar雄性大鼠,固定于立体定位仪上,使用微量注射器将荧光示踪剂注入大鼠NAc区,以标记中脑-边缘投射神经元。然后取脑、固定、切片并进行酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)免疫荧光染色进行鉴定,以确定标记细胞为多巴胺神经元。 (2)将逆行示踪大鼠取脑,振动切片,制作含有中脑的组织切片,行脑片膜片钳检测,厚度300μm,孵育后,红外相差显微镜下找到被标记细胞,在全细胞模式下记录不同浓度MA对标记神经元的影响,经前期实验比较分析,确定10μmol/L浓度的MA进行后续实验。在全细胞模式下,观察标记细胞的自发动作电位的基本电生理特点,对标记细胞进行电流注射以观察电流电压反应。 (3)施加跃阶测试电压观察产生的Ih电流并以ZD7288、CsCl进行鉴定。用10μmol/L MA作用于标记神经元,观察对Ih电流的影响,并分析Ih电流的电压和时间依赖性变化。 (4)为寻找MA抑制Ih电流的可能机制,以D2受体阻断剂舒必利提前孵育脑片后,观察MA对标记神经元自发动作电位频率和膜电位的影响,及MA对Ih电流的影响。 结果显示： (1)中脑-边缘多巴胺神经元可被荧光示踪剂准确标记,主要位于中脑的VTA区,免疫组织化学染色呈TH阳性,此结果说明被标记的神经元为中脑-边缘多巴胺神经元。红外相差显微镜下可直接观察到标记神经元。 (2)不同浓度的MA对标记神经元具有不同的作用,100μmol/L的MA可明显且迅速的抑制标记细胞的自发动作电位频率,可使标记细胞的自发动作电位停止,但去药后不能完全恢复；1.0、0.1μmo\/L的MA对标记细胞的自发动作电位频率无明显的影响；10μmol/L的MA可明显的抑制标记细胞的自发动作电位频率,使其变为对照的(0.63±0.15)%,并且去药后可以恢复。因此我们选定10μmol/L浓度的MA进行实验。发现MA可明显抑制被标记神经元的自发动作电位频率、延长动作电位时程、降低膜电位、增大后超极化电位、减小电压电流反应产生的“sag"(p0.05)."sag"即具有Ih电流的多巴胺神经元在注射超极化电流后膜电位迅速下降,而激活Ih电流后使膜电位上升,逐渐平稳,在超极化电流的注射初期形成一个膜电位的凹陷,称之为"sag"。 (3)Ih电流检测分析结果显示,在全细胞模式下,可观察到标记多巴胺神经元具有典型的Ih电流,且可被ZD7288和CsCl所阻断。MA可明显的降低Ih电流幅度(p0.05)。MA抑制Ih电流,但并未影响其时间和电压依赖常数。 (4)给予D2受体阻断剂舒必利后,发现MA对标记细胞自发动作电位频率和膜电位的抑制作用消失,并使MA产生兴奋多巴胺神经元的作用。同时使MA对Ih电流的抑制消失。 综合以上结果表明,10μmol/L MA可抑制中脑-边缘多巴胺神经元的兴奋性和Ih电流,其可能的作用机制是通过激活D2受体导致了对神经元的抑制作用。
【关键词】：MA 中脑-边缘系统 多巴胺神经元 I_h D2
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R338
【目录】：

• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 符号说明12-13
• 前言13-16
• 实验材料16-18
• 实验方法18-22
• 实验结果22-26
• 讨论26-33
• 结论33-34
• 附图34-45
• 参考文献45-51
• 致谢51-52
• 发表论文52-53
• 学位论文评阅及答辩情况表53

【参考文献】

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1 蒋庆明;新型毒品问题形势分析与对策探讨[J];公安学刊(浙江公安高等专科学校学报);2004年03期

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本文编号：986888