大剂量脑源性神经营养因子对神经细胞的作用及其可能机制

发布时间：2017-10-25 21:04

  本文关键词：大剂量脑源性神经营养因子对神经细胞的作用及其可能机制

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【摘要】：第一部分:脑源性神经营养因子对PC-12神经细胞活性的影响及其可能机制目的观察外源性脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)对PC-12神经细胞的影响及可能机制。方法体外培养高分化的PC-12神经细胞,经胰酶溶解计数后均匀接种于96孔板并分为2组:BDNF组:分别加入125μg.L-1,250μg.L-1,500μg.L-1及1000μg.L-1BDNF处理;对照组:加入相同剂量的溶剂。观察给药处理24h后PC-12细胞的数量变化。并以磺基罗丹明B法(sulforhodamine B,SRB)检测PC-12细胞的存活率。另取上述细胞于给药后24h固定,采用免疫荧光法检测细胞泛素结合蛋白P62/SQSTM1的表达变化。结果1.给药24h后神经细胞存活率的变化:与对照组相比,125μg.L-1BDNF组,250μg.L-1BDNF组,500μg.L-1BDNF组细胞存活率无明显变化(P0.05),1000μg.L-1BDNF组细胞存活率明显减低(P0.05)。2.给药24h后细胞内P62的变化:免疫荧光结果显示,与对照组对比,BDNF各剂量组细胞内P62表达均减少(P0.05),而1000μg.L-1BDNF组细胞内P62蛋白减少最明显。结论1000μg.L-1BDNF可致神经细胞存活率明显减低,可能与细胞自噬强度增加有关。第二部分:PIK3C3 siRNA-pool抑制大鼠PC-12神经细胞P62/SQSTM1的表达目的探索可高效抑制大鼠PC-12神经细胞上磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PIK3C3)表达的小干扰RNA(small interference rna,sirna)的使用剂量及作用时间,并观察其对pc-12细胞自噬的调节作用。方法设计并合成针对pik3c3的sirna3对(sirna125、sirna943、sirna2283)及一条带绿色荧光标记的阴性对照fam-sirna。在lipofectamine2000介导下转染pc-12细胞。pc-12细胞随机分为normal组,vehicle组,mismatch组,pik3c3sirna25nmol.l-1组、50nmol.l-1组、100nmol.l-1组。转染6h后,于荧光显微镜下计算转染复合物的转染效率,使用mtt法检测转染复合物的细胞毒性,采用real-timepcr法测定sirna-pool的抑制率,采用细胞免疫化学的方法检测细胞泛素结合蛋白p62/sqstm1的表达变化。结果sirna转染效率可随载体使用剂量的增加而升高。转染复合物的细胞毒性低,各组细胞成活率差异无统计学意义。pik3c3sirna50nmol.l-1组、sirna100nmol.l-1组可抑制pik3c3的表达,sirna100nmol.l-1组干扰pc-12细胞后,pik3c3mrna相对表达量较低。sirna100nmol.l-1组转染pc-12细胞48h后,p62/sqstm1的相对表达量升高。结论sirna100nmol.l-1组能有效地抑制pc-12上pik3c3mrna的表达,且引起自噬有关蛋白p62/sqstm1的表达升高,抑制pc-12细胞的自噬。第三部分:pik3c3sirna通过抑制自噬的过度激活对bdnf致大鼠神经细胞损伤的保护作用目的观察预给予pik3c3sirna转染pc-12细胞对大剂量外源性bdnf对神经细胞损伤的保护作用及其可能机制。方法将体外培养的pc-12细胞分为六组,分别为:normal组(n组),vehicle组(v组),mismatch组(m组)组,bdnf组(b组),pik3c3sirna组(s组),bdnf+pik3c3sirna100nmol.l-1组(bs组)。其中b组及bs组bdnf浓度为1000μg.l-1,bs组转染试剂pik3c3sirna于实验前24h以100nmol.l-1的浓度转染细胞后再加入1000μg.l-1bdnf作用24h。通过mtt法(n=5)检测pc-12神经细胞活性的变化、real-timepcr法(n=3)检测与自噬有关的p62/sqstm1基因及lc3基因的表达、细胞免疫化学(n=4)、细胞免疫荧光(n=4)法在蛋白水平上检测p62/sqstm1蛋白及lc3蛋白的表达变化。结果细胞活性变化:与n组比较,b组神经细胞存活率明显下降(p0.01),其他各组细胞存活率变化无统计学意义(P0.05);与B组相比,BS组神经细胞活力明显增加(P0.01)。real-time PCR结果显示:与N组相比,B组P62/SQSTM1mRNA相对表达量下降(P0.01),LC3mRNA相对表达量则增高(P0.01),S组P62/SQSTM1mRNA相对表达量增高(P0.05),LC3mRNA相对表达量则下降(P0.05),BS组P62/SQSTM1基因相对表达量下降(P0.05),LC3mRNA相对表达量则高于N组(P0.01),V组与M组基因表达水平与N组比较,差异无统计学意义(P0.05)。与B组相比,BS组P62/SQSTM1mRNA相对表达量增高(P0.01),LC3mRNA相对表达量则下降(P0.05)。细胞免疫化学与免疫荧光结果显示:与N组相比,B组P62/SQSTM1蛋白表达减少(P0.01),LC3蛋白表达增高(P0.01),S组P62/SQSTM1蛋白表达增高(P0.01),LC3蛋白表达下降(P0.01),V组、M组、BS组两类蛋白的表达水平与N组相比,差异无统计学意义(P0.05)。与B组相比,BS组P62/SQSTM1蛋白表达水平增高(P0.01),LC3蛋白水平则明显下降(P0.01)。结论PIK3C3siRNA可通过抑制自噬的过度激活对大剂量BDNF致大鼠神经细胞损伤产生保护作用。
【关键词】：转染 脑源性神经营养因子 自噬 PC-12细胞
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R614
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 前言11-15
• 参考文献13-15
• 第一部分 脑源性神经营养因子对PC-12神经细胞活性的影响15-23
• 实验材料15-16
• 实验方法16-18
• 结果18-20
• 讨论20-21
• 参考文献21-23
• 第二部分 PIK3C3 siRNA-pool抑制大鼠PC-12细胞P62/SQSTM1的表达23-35
• 实验材料23-24
• 实验方法24-27
• 结果27-32
• 讨论32-33
• 参考文献33-35
• 第三部分 PIK3C3siRNA通过抑制自噬的过度激活对BDNF致大鼠神经细胞损伤的保护作用35-47
• 实验材料35
• 实验方法35-36
• 结果36-45
• 讨论45-46
• 参考文献46-47
• 结论47-48
• 综述48-54
• 参考文献51-54
• 中英文缩略词表54-55
• 攻读学位期间公开发表的论文55-56
• 基金资助56-57
• 致谢57-58

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本文编号：1095477