肌腱干细胞Sox9基因过表达对腱—骨愈合影响的研究

发布时间：2017-11-07 12:07

  本文关键词：肌腱干细胞Sox9基因过表达对腱—骨愈合影响的研究

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【摘要】：目的:1.比较大鼠TSCs与BMSCs促进腱骨愈合能力的大小,筛选出可以更好促进腱骨愈合的种子细胞;2.将慢病毒介导的Sox9基因过表达载体转染大鼠TSCs,构建Sox9+/Scx+细胞,观察其促进腱骨愈合的效果。方法:1.沿用本课题组前期成熟的技术,分离、培养大鼠TSCs与BMSCs并通过流式细胞技术和免疫荧光技术对其进行鉴定;利用CCK-8法对TSCs与BMSCs在体外进行增殖速度的比较,同时RT-PCR检测二者成骨、成软骨以及成肌腱的相关标志物;通过在大鼠体内建立跟腱-骨愈合模型,将24只大鼠随机分为三组:TSC组、BMSC组及对照组;将细胞-纤维蛋白凝胶运用到腱骨界面,用阿尔新蓝及天狼星红染色评价腱骨界面修复情况,以此来比较两种细胞促进腱骨愈合的能力的大小。2.根据空病毒对TSCs的转染预实验,选择适合的MOI值;分组:TSC组(未转染)、Lv(将慢病毒空载体转染TSCs)组及Sox9组(将慢病毒介导的Sox9基因过表达载体转染TSCs);利用RT-PCR、WB及免疫荧光技术对Sox9表达情况进行检测,验证是否Sox9已在TSCs中过表达;CCK-8法明确慢病毒转染对细胞增殖活性的影响;通过细胞高密度培养、WB和免疫荧光技术判断转染对TSCs分化的影响;通过在大鼠体内建立跟腱-骨愈合模型,将细胞-纤维蛋白凝胶运用到腱骨界面,用阿尔新蓝及天狼星红染色等组织学方法评价腱骨界面修复情况;同时,Micro CT和体外荧光显像技术评价慢病毒转染的TSCs在体内应用的生物安全性;应用力学牵拉仪评价生物力学的改变。结果:1.TSCs与BMSCs形态相似,均高表达间充质干细胞标志物CD90,同时造血干细胞标志物CD34、内皮细胞来源干细胞标志物CD31表达阴性;TSCs在体外的增殖速度显著快于BMSCs;TSCs中成肌腱标志物表达较高,成骨标志物表达相对较低而成软骨标志物则与BMSCs相近;Micro CT扫描结果提示两种细胞均可导致腱骨界面肌腱侧异位骨化,但TSCs相对较轻;第4周和8周时,TSCs可使腱骨界面形成更多的纤维软骨细胞,同时使腱骨界面的胶原排列更整齐,成熟度更高。2.在转染后72h,可以观察到TSCs携带绿色荧光蛋白,同时RT-PCR、WB及免疫荧光结果均提示Sox9的表达升高;CCK-8法检测各组细胞在各时间点OD值结果无明显差异;通过细胞高密度培养,发现Sox9组细胞和DI组细胞有明显的聚集现象;WB和免疫荧光提示Sox9组中成软骨相关蛋白Col Ⅱ均显著升高;Sox9组的异位骨化程度则要显著高于对照组;Lv组中的心脏中看到了少量的荧光信号,而在Sox9组中大鼠的肝脏、心脏以及肾脏中均发现了较强的荧光信号;第2周时,Sox9组纤维软骨形成量与对照组并无显著差异,而第4周时二者差异显著;腱骨界面胶原排列整齐程度及成熟度Sox9组在第2、4周时均要显著高于对照组;第2、4周时,Sox9组的最大载荷与抗拉强度均要显著高于对照组。结论:1.从大鼠肌腱组织与骨髓中分离、培养的细胞经鉴定具有干细胞特性。2.大鼠TSCs在体外培养时比BMSCs增殖速度更快,可能比BMSCs更利于腱骨界面的修复。3.在体内,大鼠TSCs对腱骨界面的组织学修复效果比BMSCs好。4.利用慢病毒介导的Sox9基因过表达载体成功转染大鼠TSCs。5.TSCs过表达Sox9基因后引起细胞内成软骨相关的重要蛋白Ⅱ型胶原表达量也升高。同时,过表达Sox9的TSCs在体外经高密度培养具有成软骨分化的趋势,并且趋势比经成软骨诱导培养的TSCs更强。6.过表达Sox9基因的TSCs应用到腱骨界面后可促进腱骨界面的组织学修复,并改善生物力学强度,但同时也增大了腱骨界面局部的异位骨化以及存在重要脏器转移的风险。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R687.2

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本文编号：1152336