CAT、SOD在肝缺血再灌注损伤大鼠小肠内的表达变化

发布时间：2017-11-10 06:38

  本文关键词：CAT、SOD在肝缺血再灌注损伤大鼠小肠内的表达变化

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【摘要】：肝缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)是肝胆外科临床实践中常见并发症。HIRI的发生不仅增加肝移植术后的死亡率和发病率,还导致病人恢复延迟和愈后较差。研究发现:在缺血再灌注过程中会产生大量ROS(reactive oxygen species:ROS),这些ROS可引起严重微循环障碍。因此,由ROS引发的氧化应激被认为与HIRI的发生发展有密切关联。机体内存在多种抗氧化系统,其中超氧化物歧化酶(superoxide dismutases,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)是这个防御系统的关键抗氧化酶。它们通过清除代谢反应中产生的ROS来保护机体免受氧化应激损伤。小肠缺血再灌注损伤是小肠移植,循环性休克和绞窄性肠梗阻等疾病发生发展过程中非常常见的临床问题。研究发现:小肠缺血再灌注损伤会导致肝脏结构和功能的严重损害。反之,当肝脏缺血再灌注损伤发生,是否会使小肠结构和功能也产生严重改变?氧化应激是否也是导致这种损害的重要因素?抗氧化酶SOD和CAT的表达如何改变,是否发挥抗氧化作用?本实验首先制造大鼠HIRI模型;再灌注6小时后检测血清过氧化氢(H_2O_2)水平、丙二醛(MDA)水平;小肠组织内H_2O_2水平、MDA水平,CAT和SOD基因及蛋白表达水平。观察HIRI发生后小肠组织形态学改变和氧化应激水平,探讨CAT和SOD清除小肠组织过多ROS的抗氧化作用。目的:观察肝缺血再灌注损伤模型小肠组织形态结构的改变,小肠组织内氧化应激状态以及是否遭受过氧化损伤,抗氧化酶CAT和SOD基因及蛋白表达水平,探讨HIRI诱导小肠组织过氧化损伤机制,抗氧化酶CAT和SOD清除小肠组织过多ROS的抗氧化作用,为寻求预防和治疗HIRI诱发的小肠组织损伤提供数据参考。方法:1大鼠分组、HIRI模型制备及检测材料处理12只体重200±10g的雄性Wistar大鼠随机分为对照组(Con)和模型组(HIRI)。根据Kohli等人的操作步骤建立HIRI模型:按照0.5ml/kg的剂量腹腔注射6%水合氯醛麻醉大鼠,分离胆管蒂和肝血管,血管夹阻断供应肝左叶、肝中叶的血管和胆管蒂。30分钟后再次恢复肝脏血液循环,建立大鼠HIRI模型。对照组大鼠只分离但不夹闭胆管蒂和血管。肝脏血液供应重新恢复6小时后取血分离血清,用于肝功能指标丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性、过氧化氢(hydrogen peroxide,H_2O_2)水平、丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平检测;取大鼠肝脏和小肠中部,部分4%多聚甲醛固定,用于观察肝脏和小肠组织形态学改变(HE染色法),其余部分置于液氮,用于小肠组织内H_2O_2含量、MDA含量,抗氧化酶CAT和SOD m RNA水平和蛋白水平的表达变化。2检测指标及测定方法2.1血清ALT、H_2O_2含量、MDA含量测定全自动生化分析仪测定血清ALT水平;钼酸比色法测定血清H_2O_2水平;硫代巴比妥酸比色法测定血清MDA水平。2.2大鼠肝脏和小肠组织形态结构观察采用HE染色法观察肝脏和小肠组织形态学变化。2.3大鼠小肠组织匀浆液MDA含量测定小肠组织匀浆液中MDA含量采用南京建成测定试剂盒检测(硫代巴比妥酸比色法)。2.4大鼠小肠组织匀浆液H_2O_2含量测定小肠组织匀浆液中H_2O_2含量采用南京建成测定试剂盒检测(钼酸比色法)。2.5大鼠小肠组织CAT、SOD基因水平检测RT-PCR法测定大鼠小肠组织CAT、SOD基因水平。以目的基因CAT和SOD扩增条带灰度值与GAPDH扩增条带灰度值之比代表CAT和SOD m RNA的相对表达量。2.6大鼠小肠组织CAT、SOD蛋白水平检测免疫印迹法(Western blot)检测小肠组织CAT、SOD蛋白水平。双色红外线成像系统观察条带并分析其灰度值。结果:1大鼠肝脏、小肠组织形态结构变化对照组大鼠肝细胞整齐排列呈条索状,并放射状分布在中央静脉周围,肝血窦大小平均,无扩张充血。而HIRI组肝细胞表现为受压萎缩和严重淤血,肝血窦呈明显的充血扩张,且肝细胞胞浆内可见空泡,HE颜色变浅,部分肝细胞出现水肿,体积增大。但HIRI组和对照组小肠组织的形态结构未见明显区别。2血清ALT活性HIRI组大鼠血清ALT活性(87.43±9.06 U/L)明显高于Con组大鼠血清ALT活性(20.03±5.23U/L)。P0.013血清H_2O_2含量HIRI组大鼠血清H_2O_2含量(23.28±4.19μmol/L)明显高于Con组大鼠血清中H_2O_2含量(13.52±2.19μmol/L)。P0.014血清MDA含量HIRI组大鼠血清MDA含量(17.54±1.96 umol/L)明显高于Con组大鼠血清中MDA含量(12.69±2.29 umol/L)。P0.015小肠组织匀浆内MDA含量HIRI组大鼠小肠组织匀浆MDA含量(23.97±3.42 mmol/g)明显高于Con组大鼠小肠组织匀浆MDA含量(15.94±2.24mmol/g),P0.01。6小肠组织匀浆内H_2O_2含量HIRI组大鼠小肠组织匀浆H_2O_2含量(36.69±5.98 mmol/g)明显高于Con组大鼠小肠组织匀浆H_2O_2含量(25.98±4.08 mmol/g),P0.01。7小肠组织CAT和SOD m RNA表达水平RT-PCR法测定大鼠小肠组织CAT和SOD m RNA表达水平。HIRI组大鼠小肠组织CAT(0.55±0.09)和SOD(0.85±0.13)m RNA表达水平明显高于Con组小肠组织CAT(0.38±0.07)和SOD(0.63±0.11)m RNA表达水平,P0.01,表明:HIRI组大鼠小肠组织CAT和SOD基因表达水平增强。8小肠组织CAT和SOD蛋白表达水平Western blot法测定大鼠小肠组织CAT和SOD蛋白表达水平。HIRI组大鼠小肠组织CAT(0.59±0.08)和SOD(0.91±0.12)蛋白表达水平明显高于Con组小肠组织CAT(0.37±0.06)和SOD(0.67±0.13)蛋白表达水平,P0.01,表明:HIRI组小肠组织抗氧化关键酶CAT、SOD蛋白水平是明显增加的。结论:1小肠组织的形态结构在HIRI后虽未出现明显改变,但此时已发生氧化应激并遭受过氧化损伤。2 HIRI组大鼠小肠组织CAT和SOD基因和蛋白表达水平均升高,表明:在小肠组织处于高度氧化应激状态时,CAT和SOD在此过程中可能发挥了抗氧化应激作用。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R657.3

【参考文献】

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1 Lian-Yue Guan;Pei-Yao Fu;Pei-Dong Li;Zhuo-Nan Li;Hong-Yu Liu;Min-Gang Xin;Wei Li;;Mechanisms of hepatic ischemia-reperfusion injury and protective effects of nitric oxide[J];World Journal of Gastrointestinal Surgery;2014年07期

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本文编号：1165517