脊柱结核microRNA差异表达谱检测及早期诊断分子标记物的筛选

发布时间：2017-12-08 14:13

  本文关键词：脊柱结核microRNA差异表达谱检测及早期诊断分子标记物的筛选

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【摘要】：[研究目的]脊柱结核是骨科临床常见多发病,致残率较高。其早期诊断对疾病的发生发展和愈后起十分重要的作用。其诊断主要依靠临床表现、影像学和相关的实验室检查而确立,典型脊柱结核诊断并不困难。但在疾病早期,由于其临床表现不典型、影像学和相关实验室检查缺乏特异性,所以早期诊断仍存在较大的问题。筛查脊柱结核患者外周血单个核细胞内差异性表达的microRNA,建立可用于脊柱结核早期诊断分子标记物,并对其作用机制进行初步的探讨。[材料和方法]根据患者临床表现,影像学资料和相关的实验室检查,结合穿刺活检或手术取材病理组织学检查结果选择脊柱结核病例；在抗痨治疗实施前抽取外周血标本5mL,加入Ficoll试剂后进行梯度离心,获取单个核细胞。对照组人群来源于我院健康体检中心健康自愿者,同法获得外周血单个核细胞。再采用Trizol一步法提取总RNA并通过NanoDrop-1000系统完成质检。采用6张Exiqon miRCURY LNATM microRNA (Human)芯片对病例组(n=4)和对照组(n=3)样品进行检测,通过倍数变化(fold change, FC≥2倍)和统计学P值(P0.05),筛选出差异表达microRNA,与肺结核相关研究结果进行比对。再通过real-time PCR对32个独立样品(病例组n=20；对照组n=12)中miR-19a-3p, miR-18b-5p,miR-520g-3p和miR-1470的表达进行检测,验证芯片数据的可靠性。同时,结合Miranda、 MirBase和TargetScan数据库对差异表达的microRNA进行靶基因预测并进行GO、Network和Pathway生物信息学分析。通过分析miR-19a-3p对脊柱结核检测的特异性和敏感性,建立受试者操作特征曲线(ROC曲线),利用曲线下面积指标(AUC)评价其对脊柱结核的诊断效率。通过RT-PCR检测上述32个独立样品中肿瘤坏死因子(TNF-a)mRNA的表达,结合miR-19a-3p的数据联合分析探讨两者之间是否存在基因-靶基因关系并采用散点图呈现二者表达水平的相互关系。[结果]7个样品的质量检测结果均合格(其中病例组中两个样品获取的RNA较少,故将两组RNA样品混合用于其中1张芯片检测)。在3,100个microRNA探针中,共有58个microRNA呈现差异性表达(其中上调基因36个；下调基因22个),其倍数变化在2.07-13.8之间。与肺结核前期研究结果比较,仅有4个microRNA(has-miR-296, has-miR-377, has-miR-145和has-miR-744)为共存差异表达。RT-PCR检测结果显示：miR-19a-3p和miR-18b-5p在病例组表达降低,而miR-520g-3p和miR-1470在病例组中表达增高,其结果与芯片检测结果基本一致。生物信息学分析显示：差异表达的microRNA涉及到从多的靶基因,其中miR-19a-3p在三个数据库中均为靶基因的数量为208个(其中含TNF),在network中处于中心位置。靶基因功能GO分析主要涉及MAKP激酶活性、细胞代谢调节和巨噬细胞化学趋化等；pathway分析靶基因功能主要涉及MAKP、TNF和Rap1等信号通路。miR-19a-3p检测脊柱结核患者的敏感性为80%,特异性为66.7%,AUC为0.733。miR-19a-3p与TNF-a之间存在负相关关系(uperman's rho =0.602,p= 0.014)。[结论]脊柱结核与肺结核microRNA表达谱之间存在明显的差异；就靶基因的功能而言主要涉及MAKP、TNF和Rap1等信号通路,与前人肺结核的相关研究结果相似。miR-19a-3p可能成为脊柱结核早期诊断分子标记物之一；它可能通过调节TNF的表达参与脊柱结核的病理过程。但该结论仍有待于更大样本的验证和荧光素酶等实验的验证。
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R529.2

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本文编号：1266669