落新妇苷对大鼠肝脏缺血再灌注损伤及自噬的影响

发布时间：2018-03-01 10:52

  本文关键词： 落新妇苷 缺血再灌注 肝脏 自噬　出处：《扬州大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的1、探索大鼠正常肝脏和缺血再灌注损后肝脏中的细胞自噬现象。2、探讨落新妇苷对大鼠肝脏缺血再灌注损伤(HIRI)预处理的作用机制,观察保护效应与自噬水平的变化,为肝脏缺血再灌注损伤的治疗提供一定的依据。方法1、实验分组:54只健康SD大鼠(均为雄性,体重大约250～300g)随机分为3组,分别为落新妇苷预处理组、HIRI组(缺血再灌注组)以及Sham组(假手术组),每组18只;再按术后4h、8h、16 h三个时间段,每个时间段各6只。2、建立模型:各组大鼠术前12 h禁食、不禁水,落新妇苷预处理组,术前7天开始每日上午08:00给予落新妇苷腹腔按照剂量为每千克大鼠40毫克注射,HIRI组和Sham组给予同样剂量生理盐水每日上午08:00腹腔注射。落新妇苷预处理组和HIRI组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉后,行腹部正中切口,逐层切开,打开腹膜进入腹腔,暴露肝脏,找到第一肝门;游离支配肝左、中叶的脉管,并用无创血管夹夹闭脉管的共干,观察肝脏颜色的变化,肝左、中叶的颜色变深,即已建立约70%的肝脏缺血模型;夹闭时间大约45分钟,重新恢复血流,逐层缝合切口。Sham组仅行上腹部正中切口,逐层进入腹腔后轻轻游离肝门,无需夹闭脉管,直接缝合关腹。3、样本的采集和观察指标的测定:分别于手术后4h、8h、16h取抽取下腔静脉血及大鼠肝左外叶作为标本,检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST),光学显微镜下观察Sham组、HIRI组及落新妇苷组不同时间段的肝细胞显微结构变化;Western Blot分析肝组织中LC3、Beclin-1的表达;电镜下观察肝脏组织内自噬小体数量情况。结果1、54只健康SD大鼠手术后都能在一定时间内复苏,维持有效的呼吸与心跳,并且能相应活动。2、术后肝功能主要是检测血清ALT和AST水平的变化,HIRI组的ALT和AST水平较假手术组明显升高,而落新妇苷组与HIRI组相比明显降低,且有统计学意义(P0.05)。3、术后肝组织HE染色显示Sham组肝小叶、肝汇管区结构显示清晰,肝细胞形态正常,无炎性细胞浸润。术后4h时,HIRI组中肝细胞索排列出现紊乱,部分肝细胞出现肿胀,并有炎性细胞浸润;落新妇苷组中只见少许肝细胞水肿。术后8h HIRI组,肝细胞索排列严重紊乱,肝汇管区结构显示模糊,出现肝细胞的大片坏死;落新妇苷组肝细胞只见轻度水肿,少量炎性细胞浸润,肝汇管区结构显示清晰。术后16h HIRI组中肝细胞损伤减轻,细胞形态较前有改善;落新妇苷组中肝细胞的形态基本正常。4、通过Western blotting检测术后肝组织中LC3、Beclin-1蛋白的表达,与相Sham组比较,HIRI组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ灰度值比值及Beclin-1灰度值在术后各个时段均明显升高且有统计学意义(P0.05),在8h时达到高峰,在16h时下降。落新妇苷组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin-1灰度值比值在术后各个时段均较HIRI组下降,且有统计学意义(P0.05);结果提示落新妇苷在术后各个时段均可以减轻LC3-Ⅲ/LC3-Ⅰ蛋白比值和Beclin-1蛋白的表达。5、电镜下观察再灌注8小时三组大鼠肝脏的自噬小体的数量,结果显示,与Sham组(0.69±0.04)大鼠肝脏的平均自噬小体数量相比,HIRI组(7.12±0.60)大鼠肝脏的平均自噬小体数量有所增多,且有统计学意义(P0.05);与HIRI组大鼠肝脏的平均自噬小体数量相比,落新妇苷组(3.68±0.42)大鼠肝脏的平均自噬小体数量有所下降,且有统计学意义(P0.05)。结论结果显示,经过落新妇苷预处理后,大鼠肝脏缺血再灌注损伤后血清转氨酶水平明显下降,光镜下观察发现落新妇苷组较HIRI组肝细胞形态及炎症浸润情况等明显减轻。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ灰度值比值以及Beclin-1灰度值在术后各个时段均较HIRI组下降,提示落新妇苷可减轻术后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值和Beclin-1蛋白的表达,表明落新妇苷预处理可降低大鼠HIRI后的自噬水平。电镜下的结果显示正常大鼠术后也存在少量自噬小体,HIRI组自噬小体最多,而落新妇苷组肝脏细胞的自噬小体数量比HIRI组有所减少,这也证实了落新妇苷预处理确实降低了大鼠HIRI后的自噬水平。综上所述,正常大鼠肝脏也存在自噬现象,落新妇苷预处理可减轻大鼠HIRI,其作用机制可能与下调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值及Beclin-1蛋白的水平,从而抑制自噬有关。本实验从自噬的角度来分析落新妇苷对大鼠HIRI的保护作用,对HIRI的临床治疗提供了相关的实验依据。
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【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R657.3

【参考文献】

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本文编号：1551628