高压干燥保存小鼠心脏的机制研究

发布时间：2018-03-05 06:36

本文选题：一氧化碳　切入点：心肌冷缺血再灌注损伤　出处：《南方医科大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的终末期心脏病的治疗方法中,心脏移植无论是从病人的治愈率还是病人的术后生存时间来看,都是无可非议的,甚至是最好的。等待接受心脏移植的患者数量每年都在增加。供者来源少,受者数量却增加,对供心的要求就越来越急迫。常用心脏保存液保存离体心脏限制在4-6 h,离体供心保存时间短,限制了心脏移植手术的开展。通过改良保存液的成分,如加入钙离子、抗氧化剂等可以减轻保存过程中对供心的损伤,但效果仍不理想。如若找到一种全新的离体器官(心脏)保存方法,在保证保存质量的同时大大延长保存时间,可缓解目前供心紧缺的现状,造福广大复杂先天性心脏病和终末期心脏病的患者。本实验课题采用一氧化碳(Carbon monoxide,CO)高压干燥保存这一全新的器官保存方法,用以保存小鼠离体供心,观察一氧化碳和氧气混合气体的高压干燥保存方式是否优于目前常用的康斯特保护液(HistidiBe Tryptophan Ketoglurate Solution,HTK液)浸泡保存,并对该保存方式的可能作用机制进行探讨。方法一SPF级C57BL/6雄性小鼠,84只。供体鼠4-6周龄,体重(21±2)g,共48只;受体鼠6-8周龄,体重(29±2)g,共36只,所有实验用鼠均购自中山大学实验动物中心,饲养在屏障环境内。供体鼠随机分为4组,每组12只：空白对照组、即刻移植组、HTK浸泡保存24移植组(HTK组)及CO高压干燥保存24 h移植组(CO组)。受体鼠随机分为3组,每组12只：即刻移植受体组、HTK受体组及高压干燥受体组。供体小鼠处理：小鼠术前均不禁食禁水,称重后,10%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,麻醉成功后剪开腹壁,下腔静脉予以暴露,4℃肝素水1 mL(100 u/mL),经下腔静脉注射。剪开胸壁及膈肌,向心脏以1 mL注射器缓慢注射高钾停搏液,直至心脏完全停止跳动。分离心脏和肺脏周围组织,将心肺联合取下并迅速放入4℃装有肝素生理盐水的塑料培养皿中。供心处理：空白对照组取心后不做移植,马上取材进行相关检测；HTK保存组则是15 mL 4℃HTK液中保存24 h；高压干燥保存组则是处理完供心后悬挂于已预冷至4℃的干燥高压保存罐内。往罐内注入800 hPa的C0及3,200 hPa的02,密封后将罐置于4℃冰箱中保存24 h,注意高压灌内气体变化并及时补充气体。同系小鼠颈部异位心脏移植模型建立：受体鼠6-8周龄,按供体鼠处理方法麻醉满意后仰卧位固定。采用改良cuff方法进行小鼠异位心脏移植术。分离静脉残端多于组织,将静脉残端修正后穿入静脉套管,然后后翻呈袖套样套于套管壁上,10-0丝线套扎固定。移植后观察供心2h,记录供心复跳情况质地及颜色变化等。记录供心复跳率；依据复灌后供心的收缩强度、颜色及供心的硬度进行移植物活力评分,2h观察完毕后,缝皮,受体鼠置于电热毯保温、独笼饲养。术后供心取样检测：空白对照组小鼠取心后即刻送检,即刻移植组、HTK保存组、高压干燥保存组于移植后24h取心送检。苏木精—伊红(hematoxylin-eosinstaining,HE)染色法进行组织切片的染色,观察切片病理变化情况,缺口末端标记法(Terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,Tunnel)检测凋亡细胞,进行凋亡细胞计数(高倍显微镜下),免疫印迹法(Western-blot,WB)检测自噬标志性蛋白微管相关蛋白1-轻链3-Ⅱ(Microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ, LC3-Ⅱ)及B细胞白血病／淋巴瘤-2(B cell lymphoma/leukemia-2, Bcl-2)蛋白。结果供心移植后复跳率结果为：即刻移植组有9只复跳(n=12)、HTK保存组有1只复跳(n=12),高压干燥保存组有8只复跳(n=12),复跳率结果分别为75%、8.3%、66.7%,组间差异有统计学意义(I2=12.667,P=0.0020.01),调整检验水准a'=a/3=0.0167,多样本间行两两比较,即刻移植组与高压干燥保存组复跳率差异无统计学意义(P=0.6530.0167),高压干燥保存组复跳率明显高于HTK液保存组(P=0.0030.0167),即刻移植组复跳率明显高于HTK保存组(P=0.0010.0167)。各组移植物活力评分分别用中位数、第1四分位数(P25%)及第3四分位数(P75%)表示,即刻移植组、HTK保存组及高压干燥保存组活力评分分数为4.5(4.0-4.5)、0.75(0.5-1.0)、2.5(2.0-2.875),差异有统计学意义(P0.01)。与即刻移植组移植物功能评分比较,HTK保存组、高压干燥保存组降低(P0.01)。高压干燥保存组移植物功能评分高于HTK保存组(P0.01)。Western-blot检测发现结果：空白对照组、即刻移植组、HTK组、CO组LC3-Ⅱ蛋白表达量分别为(0.125±0.03)、(1.243±0.20)、(0.157±0.06)、(0.867±0.18),组间差异有统计学意义(F=187,P0.05)。组间行两两比较,LC3-Ⅱ蛋白在即刻移植组表达最高,空白对照组和HTK组相比,差异没有统计学意义(P0.05),CO组表达高于HTK组,差异有统计学意义(P0.01)。空白对照组、即刻移植组、HTK组、CO组Bcl-2蛋白表达量分别为(0.187±0.018)、(2.065±0.319)、(0.261±0.075)、(2.058±0.292),组间差异有统计学意义(F=280,P0.05)。Bcl-2蛋白在即刻移植组表达最高,CO组和即刻移植组相比,差异没有统计学意义(P0.05),CO组表达高于HTK组,差异有统计学意义(P0.01)。光学显微镜下观察HE染色结果,空白对照组心肌细胞染色均一,间质未见水肿,即刻移植组供心,心肌结构完整,间质稍水肿但无炎细胞浸润和红细胞渗出,HTK组供心,心肌细胞变性、细胞间质水肿,间质可见大量炎细胞浸润和红细胞渗出,CO组供心细胞排列致密,结构基本完整,染色比较均匀,间质可见少量的中性粒细胞浸润,无明显的红细胞渗出。Tunnel染色显示,光镜下空白对照组心肌细胞染色均一淡染,未发现异常核。Tunnel标记的阳性细胞细胞核呈绿色,即刻移植组心肌细胞染色均匀,未发现绿色阳性细胞,HTK组可见大量绿色阳性凋亡细胞,明显较CO组增加。空白对照组、即刻移植组、HTK组、CO组四组凋亡细胞指数分别1.08±0.56、2.13±1.71、26.72±5.23、5.04±1.77,差异有统计学意义(F=209,P0.01)。组间两两比较差异有统计学意义(P0.01)：与空白对照组、即刻移植组比较,HTK、CO两组凋亡细胞指数升高,差异有统计学意义(P0.01)； CO组凋亡指数较HTK组低,差异有统计学意义(P0.01)；空白对照组、即刻移植两组间凋亡细胞指数差异无统计学意义。方法二SPF级C57BL/6小鼠,雄性,60只。供体鼠4-6周龄,36只,体质量21±2 g；受体鼠6-8周龄,24只,体质量29±2 g,均购自中山大学实验动物中心,饲养在屏障环境内,供体鼠随机分为3组,每组12只,为空白对照组、HTK浸泡保存16h移植组(HTK组)及CO高压干燥保存16 h移植组(CO组)。受体鼠随机分为2组,每组12只,分组如下：HTK保存受体组及高压干燥保存受体组。供体小鼠处理：小鼠术前均不禁食禁水,称重后,10%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,麻醉成功后剪开腹壁,下腔静脉予以暴露,4℃肝素水1 mL(100 u/mL)经下腔静脉注射。剪开膈肌及胸壁,向心脏以1 mL注射器缓慢注射高钾停搏液,直至心脏完全停止跳动。分离心脏和肺脏周围组织,将心肺联合取下并迅速放入4℃装有肝素生理盐水的塑料培养皿中。供心处理空白对照组取心后不做移植,马上取材进行相关检测；HTK保存组则是15 mL 4℃HTK液中保存16 h；高压干燥保存组则是处理完供心后悬挂于已预冷至4℃的干燥高压保存罐内。往罐内注入400 hPa的CO及1,600 hPa的02,密封后将罐置于4℃冰箱中保存16 h,注意高压灌内气体变化并及时补充气体。同系小鼠心脏腹部异位移植模型建立：6-8周龄小鼠作为受体鼠,麻醉满意后仰卧位固定在手术台上,显微镊游离腹主动脉血管及下腔静脉血管,显微血管夹夹闭所移植部位的血管的近心端及远心端。将供体心脏放在受体小鼠腹腔右侧,10-0尼龙线将受体小鼠腹主动脉与供体心的升主动脉作端侧吻合,受体鼠下腔静脉与供体心肺动脉血管作端侧吻合。移植后的供心2h,记录供心复跳情况质地及颜色变化等。依据开放血管夹恢复血流后供心的搏动情况来记录供心复跳率；进行移植物活力评分。2h观察完毕后,缝皮,受体鼠置于电热毯保温、独笼饲养。术后供心取样检测：空白对照组小鼠取心后即刻送检,HTK保存组、高压干燥保存组于移植后24 h取心送检。取三组供心的心肌组织,苏木精—伊红HE染色法进行组织切片的染色,观察切片中心肌细胞排列、间质水肿及炎细胞浸润情况,Tunnel检测凋亡细胞,进行凋亡细胞计数(高倍显微镜下),并比较四组心肌细胞的凋亡程度,行聚合酶链式反应RT-PCR检测肿瘤坏死因子-a(Tnecrosis factor α,TNF-a),白细胞介素-1β(Interleukin-1β,JL-1β),白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6),,细胞间黏附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)和白细胞介素-10(Interleukin-10,ILI-10)的表达,推断高压干燥保存法的可能作用机制。结果供心移植后复跳率结果为：HTK保存组有3只复跳(n=12),高压干燥保存组有10只复跳(n=12),复跳率结果分别为25%、83.3%,组间差异有统计学意义(P=0.0120.05),CO组供心复跳率高于HTK组。移植物活力评分结果,各组移植物活力评分分别用中位数、第1四分位数(P2s%)及第3四分位数(P75%)表示,HTK保存组及高压干燥保存组活力评分分数为1.30(0.963-1.54)、3.50(3.125-3.938),两组间比较采用Mann-Whitney U检验,CO组移植物功能优于HTK组,差异有统计学意义(Z=-3.447,P0.01)。RT-PCR检测结果HTK组、CO组TNF-a的基因表达的相对单位为(5.095±0.421)、(3.602±0.219),HTK组表达较CO组高,t=10.902,P0.01,差别有统计学意义；HTK组、CO组IL-1p基因表达的相对单位为(4.924±0.825)(2.891±0.278),HTK组表达较CO组高,t=8.084,P0.01,差别有统计学意义；HTK组、CO组IL-6基因表达的相对单位为(5.345±0.667)、(3.033±0.320),HTK组表达较CO组高,t=10.821,P0.01,差别有统计学意义；HTK组、CO组ICAM-1基因表达的相对单位为(4.892±0.817)、(3.073±0.524),HTK组表达较CO组高,t=6.493,P0.01,差别有统计学意义；HTK组、CO组IL-10基因表达的相对单位为(3.617±0.419)、 (7.190±1.048),CO组表达较HTK组高,t=10.971,P0.01,差别有统计学意义。光学显微镜下观察HE染色结果,空白对照组心肌细胞染色均一,结构完整,HTK组供心,心肌细胞变性,间质可见大量炎细胞浸润和红细胞渗出,CO组供心细胞排列致密,结构基本完整,间质可见少量的中性粒细胞浸润,无明显的红细胞渗出。Tunnel染色显示,光镜下空白对照组心肌细胞染色均一淡染,未发现异常核。Tunnel标记的阳性细胞细胞核呈绿色,HTK组可见大量绿色阳性凋亡细胞,明显较CO组增加。空白对照组、HTK组、CO组三组凋亡细胞指数分别1.36±0.30、14.18±4.75、6.61±1.06,差异有统计学意义(F=62.963,P0.01)。组间两两比较差异有统计学意义(P0.01)；与空白对照组比较,HTK组、CO两组凋亡细胞指数升高,差异有统计学意义(P0.01)； CO组凋亡指数较HTK组低,差异有统计学意义(P0.01)。结论综上所述,高压干燥的保存方式是一种有效的心脏保存方法,该方法通过CO作用于心肌细胞,发挥抗炎症、抗凋亡的细胞保护作用,使心肌细胞中Bcl-2蛋白上调,抑制心肌细胞凋亡,该保存方法亦可能利于冷缺血过程中自噬作用的发挥,通过清除无用的细胞器和蛋白质为心肌细胞提供能量,达到保护心肌的作用,但其在供心保存过程中的机制仍值得进一步探讨。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R654.2

【相似文献】