低氧对人髓核组织来源间充质干细胞向类髓核细胞分化的诱导实验研究

发布时间：2018-03-13 15:05

  本文选题：椎间盘　切入点：髓核干细胞　出处：《苏州大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分人退变髓核组织来源间充质干细胞的分离、培养及鉴定目的目的:体外分离、培养及鉴定人退变髓核组织来源的间充质干细胞(NP-MSCs)并观察其生物学特性。方法法:收集10例腰椎间盘退行性疾病患者的髓核手术标本,采用0.05%II型胶原酶消化加贴壁法分离髓核间充质干细胞并体外培养和扩增。用倒置相差显微镜观察人髓核间充质干细胞形态、流式细胞仪检测干细胞表型分子、定向诱导人髓核间充质干细胞成脂、成骨及成软骨分化。结果果:采用0.05%II型胶原酶37℃消化4小时(h)即可从组织标本中分离出人髓核间充质干细胞。人髓核间充质干细胞原代培养3天可见细胞贴壁,30天左右达到80%融合,传至第3代后,细胞形态转变成均一的长梭形或纺锤形,呈漩涡状排列。流式细胞仪检测人髓核间充质干细胞高表达CD29和CD105,不表达或低表达CD34、CD45及HLA-DR。多向诱导21天(d)后,成骨诱导组Alizareen染色和成软骨诱导组Safranin’O染色呈阳性,成脂诱导组油红O染色阴性。结论论:采用0.05%II型胶原酶消化结合贴壁法可从人退变髓核组织中提取具有多向分化潜能的间充质干细胞。第二部分低氧对人髓核组织来源间充质干细胞向类髓核细胞分化的生物学诱导效应目的目的:探索低氧对人退变髓核组织来源的间充质干细胞(NP-MSCs)向类髓核细胞定向分化的生物学效应。方法法:在5%氧浓度下,用含转化生长因子-β3(TGF-β3)诱导培养基培养人髓核间充质干细胞,同时设立在21%氧浓度下诱导培养为对照组。诱导培养第7天(d)和14d,实时荧光定量PCR(Realtime-PCR)检测低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、SOX-9、Aggrecan和II型胶原基因的表达,诱导培养14d,采用免疫荧光法检测低氧诱导组与常氧诱导组细胞II型胶原的表达。组间比较采用独立样本t检验。结果果:NP-MSCs诱导培养第7d时低氧组HIF-1α与SOX-9基因的相对表达量高于常氧组,差异具有统计学意义(P0.05),但Aggrecan和II型胶原基因相对表达量无显著性差异(P0.05)。在诱导培养14d时,低氧组HIF-1α、SOX-9、Aggrecan和II型胶原基因相对表达量均高于常氧组,差异具有统计学意义(P0.05),免疫荧光法检测两组细胞均合成II型胶原且低氧组荧光染色较对照组深。结论论:人髓核间充质干细胞可定向分化成类髓核细胞,低氧环境有利于该分化过程。
[Abstract]:The first part: isolation, culture and identification of mesenchymal stem cells derived from human degenerative nucleus pulposus objective: to isolate in vitro, NP-MSCs derived from degenerative nucleus pulposus were cultured and identified and their biological characteristics were observed. Methods: ten specimens of nucleus pulposus were collected from 10 patients with degenerative lumbar intervertebral disc disease. Mesenchymal stem cells of nucleus pulposus were isolated and cultured and expanded by the method of type 鈪，

本文编号：1606906